论文部分内容阅读
类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种以损害滑膜、软骨和骨的慢性、炎症性的自身免疫疾病，炎症滑膜组织中浸润大量B淋巴细胞。B淋巴细胞刺激因子（B cell-activating factor of the TNF family，BAFF）对B淋巴细胞的成熟和存活起重要作用。BAFF结合其特异性受体BAFF-R （BAFF/BAFF-R）能够促进B淋巴细胞的增殖和活化。PI3K/Akt/mTOR信号通路在淋巴细胞增殖和存活中起到重要作用。然而已有的文献显示，PI3K/Akt/mTOR信号转导通路多在恶性肿瘤的病理机制和治疗方法中被研究。在RA病理机制中，BAFF/BAFF-R参与调节B细胞增殖、存活和抗体产生等过程是否是通过介导PI3K/Akt/mTOR信号转导路径而实现的？目前还不清楚。芍药苷（Paeoniflorin，Pae）是白芍总苷（total glucosidesof paeony, TGP）中的主要活性成分，具有抗炎、镇痛和免疫调节等作用，TGP能有效改善RA患者的临床症状和体征。本课题组前期研究表明，TGP通过抑制RA动物模型大鼠成纤维样滑膜细胞、巨噬细胞增殖和细胞因子的产生，调节Bcl-2、Bax凋亡蛋白的表达，而发挥对实验性关节炎大鼠的治疗作用。Pae调节胶原性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠滑膜细胞异常的G蛋白偶联的信号转导及Ras-MAPKs信号通路，而抑制滑膜炎症。Pae也能够降低CIA大鼠血清中抗II型胶原抗体而抑制B细胞的功能，那么Pae对B淋巴细胞功能调节是否通过BAFF/BAFF-R介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路来实现的？还有待进一步证明。目的：研究BAFF/BAFF-R是否通过PI3K-Akt-mTOR信号通路上调CIA大鼠B淋巴细胞的功能；探讨Pae是否通过BAFF/BAFF-R介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路调节B淋巴细胞的功能。方法：大鼠足跖、尾根部、背部皮内多点注射鸡II型胶原（chicken type II collagen，CCII）乳剂制备CIA模型，Pae (25，100mg/kg)灌胃给药（intragastric administration,ig）（d18-d38）。足容积法测量继发侧足肿胀、进行多发性关节评分；光学显微镜观察关节滑膜及脾脏的病理变化；酶联免疫吸附测定法（enzyme-linkedimmunosorbent assay, ELISA）检测大鼠血清中的BAFF，抗CII抗体，IgA，IgG和IgM水平；免疫组织化学法和蛋白免疫印迹法检测大鼠脾脏组织和脾脏B淋巴细胞中BAFF-R，P110δ，P-Akt1/2/3和mTORC1的表达水平；MTT法检测B淋巴细胞增殖反应；流式细胞技术分析B淋巴细胞凋亡百分率。结果:1. CIA大鼠B淋巴细胞功能变化及Pae对其的调节作用。致炎后d18，CIA大鼠非致炎侧关节出现不同程度肿胀，个别关节红肿，d34关节炎指数和关节肿胀度达峰值；关节滑膜和脾脏组织病理照片中出现大量的炎症，如滑膜组织增生，炎细胞浸润，脾脏白髓中边缘区和淋巴滤泡区显著增厚，生发中心明显扩大，红髓充血以及脾脏、胸腺指数增加等。CIA大鼠血清中IgA、IgG、IgM、抗CII抗体水平明显上升。这些提示了CIA大鼠B淋巴细胞的功能异常增强。Pae抑制CIA大鼠继发侧的足爪肿胀、降低多发性关节评分及改善关节滑膜和脾脏组织病理变化，降低了滑膜和脾脏组织病理评分和脾脏指数。Pae显著降低CIA大鼠血清增高的IgA、IgG、IgM、抗CII抗体水平，相关性分析表明，BAFF、IgA、抗CII抗体水平与关节炎评分具有相关性。提示Pae对大鼠CIA的治疗作用与其调节B淋巴细胞功能密切相关。2. CIA大鼠血清BAFF水平、B淋巴细胞中BAFF-R表达及Pae对其表达的影响。CIA大鼠血清中BAFF水平比正常大鼠明显升高，免疫组织化学分析发现CIA大鼠脾脏组织BAFF-R表达明显增多，BAFF-R主要表达在脾脏B淋巴细胞的淋巴滤泡区和边缘区，而生发中心表达相对较少。Pae明显降低CIA大鼠血清中BAFF水平，降低脾脏组织BAFF-R表达。提示BAFF及其受体在B淋巴细胞异常活化中起重要作用；Pae对CIA大鼠B淋巴细胞调节作用与其下调BAFF及BAFF-R表达相关。3. CIA大鼠B淋巴细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路的变化情况及Pae对其的调节作用。免疫组织化学分析发现CIA大鼠脾脏组织中P110δ、P-Akt阳性细胞数增多，表达水平明显升高。免疫印迹分析显示CIA大鼠脾脏B淋巴细胞中P110δ、mTORCl蛋白表达也显著升高。Pae可明显降低脾脏组织P110δ、P-Akt和mTORCl表达水平。提示PI3K/Akt/mTOR信号通路活化与CIA大鼠B淋巴细胞功能增强密切相关；Pae通过对PI3K/Akt/mTOR信号通路的调节进一步抑制B淋巴细胞的功能。4.体外BAFF和PI3K激动剂（IGF-1）对B淋巴细胞增殖反应和凋亡的影响及Pae的调节作用。体外BAFF和IGF-1刺激脾脏B淋巴细胞后，B淋巴细胞增殖反应明显增强，凋亡百分率明显下降。给予Pae不同剂量后，能够抑制BAFF和IGF-1刺激的B淋巴细胞增殖反应（其中Pae浓度在10-4，10-5mol/L时，P<0.05），从而促进B淋巴细胞凋亡。提示BAFF和PI3K直接参与了B淋巴细胞增殖功能作用；BAFF通过BAFF-R可能介导了下游的PI3K/Akt/mTOR信号通路而上调了B淋巴细胞增殖反应；Pae可能通过下调BAFF/BAFF-R介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制B淋巴细胞增殖反应。结论：1BAFF/BAFF-R可能通过介导PI3K/Akt/mTOR信号通路参与上调CIA大鼠B淋巴细胞功能。2. Pae调节BAFF/BAFF-R介导的PI3K/Akt/mTOR信号通路而抑制B淋巴细胞功能可能是其发挥对CIA治疗作用的机制之一。