胚胎冷冻保存是建立胚胎库的重要技术手段,是辅助生殖技术的重要组成部分。玻璃化冷冻是迄今最为先进的胚胎冷冻方法,主要应用高浓度冷冻保护剂保护细胞,通过超快速冷冻降温使冷冻液形成玻璃态,减少因冰晶形成所引起的细胞损伤。与慢速冷冻法相比,玻璃化冷冻具有操作简便、省时、冷冻损伤相对较小等优点,已成为胚胎冷冻保存的研究热点。玻璃化冷冻本身也存在一些问题,如冻存液浓度高,在常温下对胚胎有一定的毒性作用,冷冻过程也不可避免的会对胚胎造成某种程度的损害,导致冻胚后代的一些表型和分子特性的变化。本研究旨在通过比较小鼠胚胎经玻璃化冷冻-解冻后移植后代及其子代与正常繁育子代的生长发育、生理生化特性等差异,以及印记基因表达的差异,分析玻璃化冷冻对小鼠后代的潜在影响,为胚胎冷冻保存技术的完善,乃至人类胚胎库的建立提供试验参考。试验1、小鼠冷冻胚胎移植后代及其子代的部分生物学特性测定与分析为探讨C57BL/6J(B6)小鼠冷冻胚胎移植后所获小鼠及其子代的平均体增长、葡萄糖耐量和血液生化等生物学特性数据的变化。将试验分为3组:冻胚F1代组为冻胚移植后代组,即B6小鼠体外受精2-cell胚胎采用EFS法冷冻,解冻后移植到受体(ICR小鼠)输卵管内所生小鼠,其中雄鼠30只、雌鼠20只;冻胚F2代组为冻胚移植所生小鼠成熟后经自然交配获得的后代,其中雄鼠26只、雌鼠17只;对照组为正常饲养和自然交配所获子代,雌雄小鼠各20只。3组小鼠饲养至16 wk,每周定时测定体重,8 wk时测定各组小鼠葡萄糖耐量,至16 wk时采血,测定各组小鼠血清生化指标,并进行分析比较。结果显示,冻胚Fl代雌雄小鼠初生重和1～16wk的平均体重均显著高于对照组(P<0.01);冻胚F2代雌鼠体重从12wk开始均显著高于对照组(P<0.01),而雄鼠只有部分周龄与对照组有差异,其余周龄则无显著差异。冻胚F1代和F2代组小鼠灌服葡萄糖后各个时间点的血糖水平均极显著高于对照组(P<0.01),冻胚F2代组在血糖耐受上相对F1代组有所改善。冻胚F1代和F2代组小鼠的血清生化值与对照组相比除谷草转氨酶、总蛋白和血钙等项目无显著变化外,其余项目均有显著或极显著的上调或下调。结果表明,冷冻对胚胎移植小鼠及其子代的平均体增长、葡萄糖耐量和血清生化值有明显影响。试验2、小鼠冷冻胚移植后胎鼠分子特性及胎鼠与胎盘印记基因H19/Igf2和Ube3a的表达与分析为分析C57BL/6J(B6)小鼠冻胚移植后胎鼠分子特性及胎鼠和胎盘印记基因H19/Igf2和Ube3a的表达变化,探讨超低温冷冻对后代分子特性和印记基因表达的影响。取小鼠体外受精2-cell胚胎,采用EFS法冷冻-解冻后移植到受体ICR小鼠输卵管内,采集怀孕14 d胎鼠和胎盘,并设置正常饲养和自然交配的同品系孕鼠作为对照。每组孕鼠作3个重复采样,每个重复3～5只孕鼠,每组计采集10只胎鼠或胎盘。首先通过基因芯片宏观上了解冻胚移植后各个基因表达量的变化,然后通过荧光定量PCR法测定H19、Igf2和Ube3a基因mRNA的相对表达量,亚硫酸氢盐法测定H19/Igf2印记调控区域一段CpG岛甲基化水平,然后荧光定量PCR法测定DNA甲基转移酶(Dnmts)Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b mRNA相对表达量;用以两组的比较与分析。结果表明B6小鼠冻胚解冻移植后胎鼠基因表达与对照组相比存在差异,其中有595个基因表达显著上调,760个基因表达显著下调(P<0.05)。荧光定量分析表明印记基因H19、Igf2和Ube3a的表达水平显著下调(P<0.01),H19/Igf2印记调控区域CpG岛甲基化水平显著下降(P<0.01)。荧光定量PCR分析Dnmt1、Dnmt3a和Dnmt3b基因的表达,其表达水平也较对照组极显著下调(P<0.01)。由芯片检测结果可知,冻胚移植2 wk后胚胎有多个基因的表达发生变化,荧光定量结果发现胎鼠和胎盘印记基因H19、Igf2和Ube3a表达水平均下调,而H19和Igf2基因调控区甲基化水平显著下调。此外,甲基化转移酶Dnmts的表达也较对照组下调,使基因组甲基化水平降低。综合试验1和试验2的结果,我们可以发现冷冻胚胎对印记基因H19、Igf2和Ube3a的表达产生了影响;这种影响可持续到小鼠出生之后,表现在体增长、血清生化及葡萄糖耐量等方面的变化,并且这些变化即使到小鼠成年乃至其子代都依然存在。