第一部分 BMSCs和卵巢颗粒细胞的分离培养及鉴定　　目的:分离培养获取高度纯化的BMSCs和卵巢颗粒细胞。　　方法:无菌操作下获取6-8周C57BL/6J小鼠的股骨及胫骨，截去两侧干骺端，培养基反复冲洗骨髓，离心获得细胞层，重悬并制备成细胞悬液，常规培养和传代，取状态良好的第4代BMSCs用作鉴定（流式细胞仪检测CD29、CD34、CD45表面标志，纯度达到90%即可认为已纯化）；无菌条件下获取40周老龄雌鼠双侧卵巢，体视显微镜下机械法分离卵泡，吹打脱颗粒，200目滤网过滤，获取颗粒细胞并制备成单细胞悬液，接种于爬片上，常规培养，取状态良好的细胞进行免疫荧光分析（细胞表面标志FSHR表达，带红色荧光）。　　结果:流式鉴定结果显示CD29表达占99.6%，CD34与CD45分别为0.4%、1.5%；免疫荧光结果提示颗粒细胞形状多样，随机获取三个显微视野，细胞表面基本都显示红色荧光。　　结论:第4~9代BMSCs可达高度纯化，并可用于后续实验；以上方法可提取出高度纯化的卵巢颗粒细胞。　　第二部分 BMSCs对老龄化卵巢颗粒细胞生物学行为的影响　　目的:通过观察BMSCs对颗粒细胞生物学行为的影响，并探索其机制。　　方法:选用第四代及以上的BMSCs与老龄小鼠卵巢颗粒细胞通过Transwell小室共培养72h，实验分为颗粒细胞-BMSCs共培养组（BMSCs+GCs）及颗粒细胞单独培养组（GCs）。72h后，分别收集两组培养基，离心获取培养上清，采用ELISA技术检测上清中雌、孕激素水平，并比较分析共培养后两组颗粒细胞功能；利用CCK-8法分别检测两组颗粒细胞的活力，间接反应颗粒细胞的增殖能力；采用磷脂结合蛋白V/PI细胞凋亡检测试剂盒检测两组颗粒细胞凋亡情况，并用WB分别检测凋亡相关蛋白Caspase家族及Bcl2/Bax的表达情况。　　结果:与单独培养组相比，共培养组颗粒细胞增殖能力增强，流式凋亡检测及WB技术均提示共培养组细胞凋亡减弱，凋亡相关蛋白Bcl-2表达水平显著上升，Bax、Caspase9及Caspase3水平均下降；培养上清中雌、孕激素分泌水平均呈上升趋势。　　结论: BMSCs与老龄化小鼠卵巢颗粒细胞共培养可改善颗粒细胞的分泌功能、促进其增殖，抑制其凋亡。　　第三部分 BMSCs通过激活Mfn2/线粒体途径影响颗粒细胞的生物学行为　　目的:明确BMSCs能激活老龄小鼠卵巢颗粒细胞中Mfn2表达，从而可以调控线粒体功能。　　方法:选用第四代及以上的BMSCs与老龄小鼠卵巢颗粒细胞通过Transwell小室共培养72h，实验分为BMSCs-颗粒细胞共培养组（BMSCs+GCs）及颗粒细胞单独培养组（GCs）。72h后，分别采用免疫印迹（Western blot）技术及RT-PCR检测各组颗粒细胞Mfn2 mRNA和蛋白的表达水平；采用ATP检测试剂盒（S0026）检测两组细胞ATP水平；并采用线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）分别检测两组细胞线粒体膜电位水平，分别采用流式和荧光显微镜检测或观察各组细胞线粒体染色强度，以此代表线粒体膜电位水平(Image-pro plus6.0图像分析软件）。　　结果: BMSCs与颗粒细胞共培养，72h后检测，Mfn2 mRNA表达呈上升趋势，蛋白表达水平显著提高；JC-1染色检测显示共培养组线粒体膜电位水平上升以及ATP水平较单独培养组明显升高。　　结论: BMSCs可上调老龄小鼠卵巢颗粒细胞中Mfn2的表达以及改善线粒体功能来改善老龄小鼠颗粒细胞的功能、增殖及凋亡。