BJ46a(46-kDa isoform a from B.jararaca)是来自美洲矛头蝮( Bothrops jararaca)血清的一类金属蛋白酶抑制剂,属cystaitin超家族的胎球蛋白(fetuin)家族成员。BJ46a能有效抑制蛇毒金属蛋白酶(snake venom metalloproteinases, SVMPs)蛋白水解活性,作用位点在金属蛋白酶结构域。鉴于SVMPs与基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)同属于Metzincins (锌依赖金属蛋白酶)家族,因此BJ46a可能通过与MMPs结合,抑制肿瘤的侵袭和转移。本研究应用基因工程技术,以毕赤酵母表达系统生产重组的BJ46a蛋白,并分析其蛋白的生物学活性,为进一步开发BJ46a作为抗肿瘤侵袭转移的新药做前期准备。一、BJ46a基因表达载体的构建应用分子克隆技术,PCR扩增蛇毒BJ46a基因,通过KpnⅠ和XbaⅠ双酶切将其克隆至酵母pPICZαA载体,获得pPICZαA-BJ46a质粒,为生产重组BJ46a蛋白提供正确的目的基因。二、BJ46a基因在巴斯德毕赤酵母系统中的表达及纯化构建毕赤酵母重组表达质粒pPICZαA-BJ46a,电击法转化甲醇营养型酵母细胞GS115,利用不同浓度的抗生素zeocin筛选高表达株,通过PCR扩增获得阳性转化子GS115-BJ46a;1%甲醇诱导培养后,Tris-Tricine聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot分析表明蛇毒BJ46a基因在毕赤酵母中能有效分泌表达,表达产物分子量约为38kDa左右,凝胶扫描分析显示表达产物全为重组BJ46a蛋白。利用ProBond蛋白纯化系统对BJ46a重组蛋白进行纯化,每升发酵液可获得约10 mg纯化的重组蛋白。三、重组BJ46a蛋白理化性质鉴定和生物学活性分析重组BJ46a蛋白的理化性质鉴定:通过等电聚焦电泳测定,其等电点约为5.8。通过高效液相色谱测定,其纯度为100%。通过质谱鉴定其分子量38754Da。利用EnzChek Gelatinase/Collagenase Assay Kit测定,结果表明重组蛋BJ46a白具有抑制MMPs的活性。本研究结果证明利用巴斯德毕赤酵母系统能有效的表达重组BJ46a蛋白,并且表达的重组蛋白具有抑制MMPs的活性,为其作为抗肿瘤侵袭与转移药物的开发和应用提供理论依据和前提条件。