【摘 要】
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信号肽酶可以切割信号肽促使成熟蛋白释放到胞外,其中I型信号肽酶主要切割Sec途径和Tat途径的信号肽,而Sec和Tat分泌途径是芽胞杆菌中外源蛋白分泌的主要途径,因此研究I型信号肽酶的功能以及对外源蛋白分泌的影响十分必要。本课题以实验室保藏菌株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TCCC19030为出发菌株,将转录组数据与NCBI数据库比对确定了在基因组上存在四个
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信号肽酶可以切割信号肽促使成熟蛋白释放到胞外,其中I型信号肽酶主要切割Sec途径和Tat途径的信号肽,而Sec和Tat分泌途径是芽胞杆菌中外源蛋白分泌的主要途径,因此研究I型信号肽酶的功能以及对外源蛋白分泌的影响十分必要。本课题以实验室保藏菌株解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）TCCC19030为出发菌株,将转录组数据与NCBI数据库比对确定了在基因组上存在四个I型信号肽酶:Sip A、Sip S、Sip W和Sip V,并采用分子对接技术将基因组上四个I型信号肽酶与50条信号肽进行了分子模拟对接,分析信号肽酶与信号肽的相互作用,根据统计的结合能平均值,表明信号肽酶与信号肽的结合能力强弱顺序如下:Sip A（-5.11）＞Sip S（-3.12）＞Sip W（-2.74）＞Sip V（-0.43）。为进一步评价信号肽酶与信号肽之间的关系,在B.amyloliquefaciens中分别构建了三株信号肽酶缺失的菌株:19030-ΔsipA、19030-Δsip S以及19030-Δsip W,结合模拟对接结果选取了8条不同的信号肽:Ydb K、Nuc B、Phr F、Yhd C、Yol C、Ywj E、Ypj P和Ykn X,构建了24株重组菌株,以碱性蛋白酶为报告蛋白,以胞外酶的酶活力作为评价指标,证明了不同的信号肽酶和信号肽共同作用于外源蛋白的分泌。为探究I型信号肽酶对不同外源蛋白分泌的影响,分别以融合蛋白、绿色荧光蛋白、氨肽酶和碱性蛋白酶为报告蛋白,构建了不同的重组菌株,结果表明信号肽酶基因sip S、sip W和sipA的缺失对绿色荧光蛋白以及融合蛋白的分泌影响不显著,对氨肽酶和碱性蛋白酶的分泌有一定的影响,其中,信号肽酶sip W基因的缺失使氨肽酶的酶活力比对照降低了18.8%,信号肽酶sipA基因的缺失使碱性蛋白酶酶活力比对照降低了21.2%,表明对于不同外源蛋白的分泌起关键作用的信号肽酶不同。基于信号肽酶基因sipA的缺失对碱性蛋白酶的分泌影响较大,本研究将该基因整合到了出发菌株TCCC 19030基因组amy E基因的位置以期提高碱性蛋白酶的酶活力,结果表明整合菌株19030-Δamy E::sipA比出发菌株的酶活力提高了约19.9%,这为外源蛋白高产菌株的构建提供了一定的参考。
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