基于医药及生物工程等领域对基因改造的需求,开发高效稳定的基因编辑技术一直是基础及应用生物学的研究热点。当前,小片段外源基因的转入在大多数物种中均可实现,但大片段的转入仍存在一定的困难。鉴于DNA双链断裂（DSB）的产生可以大幅提升靶点处的同源重组效率,本研究尝试在酵母中通过定向诱导多个DSB的产生,实现大片段基因的重组整合,并研究多个DSB同时存在时,其空间距离,相对位置对DNA重组效率的影响及其分子机制。为促进大片段外源基因的稳定转入,本研究构建并优化了 I-SceⅠ内切酶介导的DSB诱导及重组系统。首先,通过引入以I-SceⅠ为核心的GIM基因表达盒,设计构建了单DSB及间距可调节的不同间距双DSBs模型菌株。本课题最初推测当两个DSB同步产生且间隔较近时,双DSB中间的序列会发生掉落,从而有利于大片段外源基因的整合,但研究发现即使DSB之间的距离很短也不会引起其中间的序列的掉落。除此之外,本研究发现双DSB中上游DSB处的转化效率较下游出现明显提升,且双DSB之间的距离越近,其转化效率的提升越为显著。通过引入外源基因,证明该模型可成功表达目的蛋白,具有一定的实际应用潜力。在此基础上,本研究发现双DSBs之间的距离越短,其修复难度及对细胞的致死性增加。从该现象入手,通过敏感性实验和RT-PCR等技术,系统性筛查了 HR和NHEJ修复途径中的各关键基因,在单DSB及不同间距双DSBs菌株中对DNA修复的影响。结果表明,当DSB间距小于1000 bp时,细胞的生长被抑制,而其间距大于1000 bp时,菌株生长无明显变化,表明间距较近的双DSB对彼此的修复产生影响。然而,敲除HR通路中的关键基因RAD51后,双DSB间距2000 bp的菌株敏感性增强,而4000 bp的菌株仍与野生型相近,说明双DSBs间距较近时,双DSBs菌株较单DSB菌株,其修复更依赖于同源重组。进一步敲除了参与DSB修复和重组关键步骤resection的关键基因MRE11,RAD50,XRS2,尽管三者结合在一起形成MRX复合物共同作用,但结果表明在双DSB间距较远时,MRE11基因的缺失对修复仍存在明显影响,揭示了其更深层的重组及修复机制。综上所述,本文通过诱导表达I-SceⅠ内切酶,在酵母同一染色体上定向同步产生多个DSB位点,尝试构建可介导大片段外源基因整合重组的酵母基因编辑系统。此外,以之为模型研究了多DSB的空间相对位置对彼此修复及重组效率的影响。为进一步优化并应用该重组模型,探究双DSBs的修复机制提供了重要的理论依据。