【摘 要】
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目的:通过构建沉默Bmi-1及过表达Bmi-1稳转细胞株,探讨Bmi-1经PI3K/Akt/GSK-3β信号通路对口腔鳞癌侵袭、迁移的影响。方法:（1）通过GEPIA数据库分析Bmi-1在头颈部鳞癌中的表达与生存;应用RT-q PCR、Western blot技术分别检测Bmi-1在CAL-27、SCC-25及正常口腔粘膜上皮细胞的表达情况;选择Bmi-1表达量相对较高的口腔鳞癌细胞株进行沉默及过
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目的:通过构建沉默Bmi-1及过表达Bmi-1稳转细胞株,探讨Bmi-1经PI3K/Akt/GSK-3β信号通路对口腔鳞癌侵袭、迁移的影响。方法:（1）通过GEPIA数据库分析Bmi-1在头颈部鳞癌中的表达与生存;应用RT-q PCR、Western blot技术分别检测Bmi-1在CAL-27、SCC-25及正常口腔粘膜上皮细胞的表达情况;选择Bmi-1表达量相对较高的口腔鳞癌细胞株进行沉默及过表达。（2）通过体外sh RNA感染口腔鳞癌细胞,构建sh RNA-Bmi-1稳转细胞株,应用倒置荧光显微镜观察sh RNA-Bmi-1感染效率;RT-q PCR及Western blot检测感染后的口腔鳞癌细胞中Bmi-1 m RNA及其蛋白表达水平的变化,筛选出最佳干扰作用的Bmi-1靶序列为后续实验组,通过CCK-8实验、划痕实验以及Transwell侵袭迁移实验检测沉默Bmi-1对口腔鳞癌细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。（3）过表达Bmi-1慢病毒感染口腔鳞癌细胞CAL-27并筛选稳转细胞株,RT-q PCR及Western blot检测Bmi-1 m RNA及蛋白水平的表达,通过CCK-8实验、划痕实验以及Transwell侵袭迁移实验检测过表达Bmi-1对口腔鳞癌细胞生长、迁移和侵袭能力的影响。（4）构建Bmi-1沉默/过表达细胞株,采用Western blot检测PI3K、Akt、GSK-3β及其磷酸化蛋白的表达情况。结果:（1）通过GEPIA数据库分析发现头颈部鳞癌组织转录水平显著高于癌旁组织,生存分析结果表明过表达Bmi-1的患者总体病死率较高,低表达Bmi-1的患者预后较好（p＜0.05）。Bmi-1在口腔鳞癌细胞株CAL-27和SCC-25的表达水平显著高于正常口腔粘膜上皮细胞（p＜0.05）。（2）成功构建Bmi-1沉默细胞株,倒置荧光显微镜检测细胞感染效率90%左右;通过RT-q PCR及Western blot检测结果显示:与空白对照组相比,Bmi-1 sh RNA-2表达水平相对较低（p＜0.05）,故后续实验选用Bmi-1 sh RNA-2稳转细胞。CCK-8实验、划痕实验以及Transwell侵袭迁移实验结果:与空白对照组相比,sh RNA-2 Bmi-1能够抑制口腔鳞癌CAL-27细胞的生长、侵袭和迁移（p＜0.05）。（3）成功构建Bmi-1过表达细胞株,倒置荧光显微镜检测细胞感染效率90%左右;RT-PCR及Western blot检测显示:与空白对照组相比,过表达Bmi-1细胞的m RNA和蛋白表达水平明显升高（p＜0.05）。CCK-8实验、划痕实验以及Transwell侵袭迁移实验结果显示:过表达Bmi-1促进口腔鳞癌CAL-27细胞的生长、侵袭和迁移（p＜0.05）。（4）通过Western blot检测沉默/过表达Bmi-1的细胞中PI3K、Akt、GSK-3β及其磷酸化蛋白的的表达,结果显示:与sh RNA-NC相比,沉默Bmi-1中PI3K、Akt以及p-Akt蛋白表达下降;而GSK和p-GSK-3β蛋白表达无明显变化。与NC组相比,过表达Bmi-1中Akt降低,而p-PI3K表达上升（p＜0.05）。加入PI3K/AKT/GSK-3β信号通路抑制剂LY-294002处理48h后,用Western blot表明沉默Bmi-1与sh RNA-NC对照组相比PI3K、Akt、p-GSK-3β蛋白磷酸化程度均降低,而GSK-3β升高,p-PI3K、p-Akt无明显变化,过表达Bmi-1在PI3K、GSK-3β、p-Akt中降低,在Akt、p-PI3K及p-Gsk中则无明显变化（p＜0.05）。结论:Bmi-1在口腔鳞癌中高表达,靶向沉默Bmi-1能特异性抑制口腔鳞状细胞癌的生长、侵袭和迁移能力。过表达Bmi-1则促进口腔鳞癌细胞的生长、侵袭和迁移能力。Bmi-1影响PI3K、Akt、GSK-3β及其磷酸化蛋白的表达。
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