骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)是一类具有多向分化潜能的组织干细胞,在体内外适当的诱导环境下可以分化成为骨、软骨、脂肪、肌肉、神经、肌腱及韧带等多种细胞和组织。该细胞来源充足,取材方便,增殖能力强,可以在体外大规模扩增而不丢失多向分化潜能,并且异体移植免疫排斥反应小。目前,已成为应用较广泛的重要种子细胞之一。为了获得充足的骨髓基质干细胞来源,我们建立了猪骨髓基质干细胞的分离方法,通过体外培养和生物学鉴定,证实其为骨髓基质干细胞,并具有成骨分化性能。通过体外转导pEGFP-C1-TGF-β1入骨髓基质干细胞,在条件培养基作用下诱导其向软骨细胞分化。以期为骨组织工程和软骨损伤修复的研究提供新的策略,获得了以下结果:1.无菌采取猪股骨头,采用骨钳钳破骨髓腔,收集骨髓液于无菌离心管,沉淀制成悬液接种于培养皿,于37℃、5 % CO2条件下培养。培养的细胞为单层贴壁生长,呈成纤维样形态。CD44因子免疫组化鉴定为阳性;条件培养基诱导成骨分化,ALP染色阳性,并有矿化结节生成;结合细胞形态学观察,结果表明,分离培养的细胞为骨髓基质干细胞。开始时大多为细长梭形,增殖速度快,细胞传代周期延短,待传至第7、8代时细胞铺展得宽大而扁薄,增殖速度减慢,细胞传代周期延长,细胞内颗粒物质增多。2.从猪外周血淋巴细胞中抽提总RNA,并用TGF-β1特异性引物扩增获得TGF-β1全基因,并将TGF-β1全基因亚克隆到带有绿色荧光蛋白报告基因的真核表达质粒pEGFP-C1。3.并用脂质体法转染BMSCs,通过直接荧光观察pEGFP-C1-TGF-β1融合蛋白在细胞中的分布定位,结果在转染后观察到绿色荧光,间接免疫荧光法检测TGF-β1表达均为阳性,转染后细胞失去BMSCs典型的成纤维形态,而呈现出三角、多角形态。Ⅱ型胶原免疫组化染色检测显示,转染TGF-β1基因后的BMSCs开始表达软骨细胞表面特异性标志物Ⅱ型胶原。综上所述,本研究在成功分离培养猪BMSCs的基础上,将TGF-β1基因转入BMSCs后,表达了软骨细胞表面标志物,说明BMSCs已向软骨细胞分化。