乳腺癌是目前世界上第二最常见的癌症并且在癌症致死原因中居第五位。紫杉醇(paclitaxel,taxol PTX)通过与微管蛋白结合促其形成微管并抑制其解聚而起到抗肿瘤作用。目前,广泛的应用于乳腺癌、肺癌、卵巢癌等实体瘤的治疗,但是其毒副作用在一定程度上限制了他的应用。异硫氰酸苯乙酯(phenethyl isothiocyanate PEITC)是新发现的去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor HDACi),能与微管蛋白结合,在体内和体外抑制肿瘤细胞生长和诱导其凋亡。最主要的是在实验室研究和健康志愿者中进行的Ⅰ期临床试验,均未发现毒副反应。由于这两种药的不同的抗肿瘤作用,我们期望他们联合应用能够增强抗肿瘤作用而减少毒副作用。目的研究PEITC和PTX两药联合作用是否具有协同的抗肿瘤的效应；分析并试图探明两药联合作用的相互关系；进一步探索两药联合作用产生协同效应的机制；为临床联合化疗的应用提供实验基础。方法根据细胞的生长特性将处于指数生长期的乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231分别分为7组(接受不同浓度的单药PEITC处理)和7组(接受不同浓度的单药PTX处理),分析各组细胞的抑制率,为进一步的联合给药选取最适药物浓度；将处于指数生长期的乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231分别以PTX为固定最适浓度,选取一定的范围的PEITC的浓度处理两系细胞48小时,或者以PEITC为固定最适浓度,选取一定的范围的PTX的浓度处理两系细胞48小时,然后应用MTT法检测各组细胞的抑制率；通过分析获得的各处理组的实验数据,明确PTX与PEITC之间是否具有协同抗肿瘤的作用。若存在协同抗肿瘤的作用,依据前面所得的实验条件,应用一般传代方法收集的处于指数生长期的MCE7和MDA-MB-231两系细胞,在25ml培养瓶中培养两系细胞(药物处理组为PEITC+PTX组,单药PEITC组,单药PTX组),收集对照组及经药物处理后的细胞,按照流式细胞仪检测的流程,制成标本,用PI染色后上流式细胞仪机器分析,取得细胞周期的表达情况；按照原位细胞凋亡(TUNNEL)法检测细胞凋亡的流程和要求,制取TUNNEL法分析细胞凋亡分析的标本,分析细胞凋亡的情况。按照Western-Blot的流程制取标本,用其分析各蛋白的表达情况。按照HDAC6活性检测试剂盒的说明,制取标本,分析不同的药物使用方案对HDAC6活性的影响。按照激光共聚焦显微镜操作的要求,获取标本,对不同的组进行激光共聚焦显微镜。统计学分析：采用SPSS10.0版统计软件的进行统计学分析,统计学处理采用t检验、单因素方差分析,多重比较采用LSD法,构成比的比较采用卡方检验,以p<0.05为差异有显著性意义,以p<0.01为差异极有显著性意义。IC50,半数抑制浓度和协同效应使用Calcusyn计算软件(Biosoft, Inc)求得。结果1.PEITC和PTX对乳腺癌细胞的影响PEITC对MCF7作用24小时和48小时后的IC50分别为9.23μM和5.61μM；PEITC对MDA-MB-231作用24小时和48小时后的IC50分别为22.46μM和15.69μM；结合曲线的走势,我们可知,PEITC对MCF7和MDA-MB-231细胞的抑制作用具有浓度和时间依赖性。结合该曲线和国内外实验用药浓度及临床血药浓度分布特点,我们选定PEITC5μM和10gM作用48小时分别为MCF7和MDA-MB-231细胞的在该实验的实验终浓度。PTX对MCF7作用24小时和48小时后的IC50分别为1870.11nM和111.26nM；PEITC对MDA-MB-231作用24小时和48小时后的IC50分别为2214.32nM和409.58nM；结合曲线的走势,我们可知,PTX对MCF7和MDA-MB-231细胞的杀伤作用具有浓度和时间依赖性。结合该曲线和国内外实验用药浓度及临床血药浓度分布特点,我们选定PTX10nM和100nM作用48小时分别为MCF7和MDA-MB-231细胞的在该实验的实验终浓度。2.PTX与PEITC同时联合用药的抗肿瘤作用情况以固定的PTX浓度分别与PEITC各种浓度作用,在MCF7和MDA-MB-231细胞中PEITC的IC50分别降低了2.6倍和7.3倍。以固定的PEITC浓度分别与PTX各种浓度作用,在MCF7和MDA-MB-231细胞中PTX的IC50分别降低了37倍和50倍。应用CalcuSyn2.0软件分析PEITC与PTX在MCF7细胞中的联合应用发现：在MCF7细胞中,两药联合在很多点均有协同的抗肿瘤作用,其中PEITC5μM作用效果最好,PTX10nM作为联合作用效果最好。在MDA-MB-231细胞中,两药联合在很多点均有协同的抗肿瘤作用,其中PEITC10μM作用效果最好,PTX100nM作为联合作用效果最好。3.PEITC与PTX联合应用对乳腺癌细胞系细胞周期的影响我们发现在MCF7细胞系PTX10nM能使6.34%的MCF7细胞停滞在G2/M期,PEITC5μM能使8.94%的的MCF7细胞停滞在G2/M期,联合起来共同作用于MCF7细胞系时会有43.2%的细胞停滞于G2/M期(统计分析结果：PEITC组与PEITC+PTX组相比P=0.0012<0.01,PTX组与PEITC+PTX组相比P=0.002<0.01),在MDA-MB-231细胞系PEITC10μM和PTX100nM单药分别能产生17.08%和14.35%的G2/M细胞停滞,而联合应用则会达到57.1%的G2/M细胞停滞(统计分析结果：PEITC组与PEITC+PTX组相比P=0.003<0.01,PTX组与PEITC+PTX组相比P=0.006<0.01)4.PEITC与PTX联合应用对乳腺癌细胞凋亡的影响我们发现在MCF7细胞PTX10nM单药作用的凋亡率为9.7%±2.8,PEITC5μM单药作用的凋亡率为8.1%±3.9,而当我们将其联合起来共同作用于MCF7细胞系时会有28.1%±3.9凋亡率出现(统计分析结果：PEITC组与PEITC+PTX组相比P=0.003<0.01,PTX组与PEITC+PTX组相比P=0.002<0.01)。在MCF7细胞系中联合用药分别比PEITC和PTX单药诱导的凋亡率高出3．4倍和2.8倍。同样的,在MDA-MB-231细胞系PEITC10μM和PTX100nM单药分别能产生12.8%±2.9和14.5%±3.7的凋亡率,而联合应用则会达到32.7%±4.8的凋亡率(统计分析结果：PEITC组与PEITC+PTX组相比P=0.004<0.01,PTX组与PEITC+PTX组P=0.001<0.01)。在MDA-MB-231细胞系中联合用药比PEITC和PTX单药诱导凋亡率高出2倍。5. PEITC与PTX联合应用对乳腺癌细胞CyclinB1和cdk1表达的影响PEITC和PTX联合作用与分别单药作用能够更显著的cdk1的表达,与此同时,cyclinB1的表达保持相对的稳定,显示在两药同时作用是主要是抑制CDK1而较少的抑制CyclinB1。6.PEITC与PTX联合应用对乳腺癌细胞Bax和Bcl-2表达的影响通过研究发现在两系乳腺癌细胞系中两药联合组其Bcl-2的表达较PEITC和PTX单药均明显降低,而Bax在两药联合用的标本中的表达较PEITC和PTX单药均明显增高。7.在两药联合对乳腺癌细胞PARP和Caspase的表达的影响我们发现两药联合作用组的PARP-1裂解片段较PEITC和PTX单药作用组的PARP-1和Caspase9的裂解片段明显增加。而采用WesternBlot方法从蛋白水平观察Caspase9和Caspase3在单药或联合用药组诱导乳腺癌细胞凋亡前后的活化情况发现,在联合用药组总的Caspase9和Caspase3较单药作用时均明显降低。8. PEITC对乳腺癌细胞浆中HDAC6活性、微管蛋白和乙酰化α-微管蛋白的影响PEITC不同的浓度作用下,乳腺癌细胞中乙酰化的α-微管蛋白会逐渐增加,而与之相对的表现出HDAC6活性的逐渐减低。相同的作用时间内随着PEITC的作用浓度逐渐增高,HDAC6的活性测逐渐减少,从PEITC2.5μM开始,在乳腺癌细胞就产生抑制,PEITC2.5μM对MCF7细胞和MDA-MB-231细胞分别能够对HDAC6的活性产生约20%和10%的抑制；当我们给予20μM的PEITC浓度时,能够对MCF7和MDA-MB-231分别产生约70%和60%的抑制。用激光扫描共聚焦显微镜和WesternBlot进行分析,发现PEITC作用后,乳腺癌细胞内的乙酰化的α-微管蛋白增加。随着PEITC浓度的增加,乳腺癌细胞的微管蛋白的表达逐渐减少,到20μM时,乳腺癌细胞的微观蛋白表达几乎就没有了。两药联合应用48小时后α-微管蛋白(α-tubulin),β-微管蛋白(β-tubulin)较任何单药降低的更明显,与此相对应的是乙酰化的α-微管蛋白(acetyl-a-tubulin)联合用组较任何单药组明显升高。结论与创新点1.PEITC和PTX联合应用对乳腺癌细胞能够产生协同的抗肿瘤效应；2.PEITC和PTX联合应用对乳腺癌细胞能够协同的诱导G2/M细胞周期阻滞、细胞凋亡效应；3.PEITC作为去乙酰基酶抑制剂(HDACi)能够抑制乳腺癌细胞浆中HDAC6的活性；4.PEITC作为去乙酰基酶抑制剂(HDACi)能够增加乳腺癌细胞浆中乙酰化的微管蛋白的表达；5.PEITC作为去乙酰基酶抑制剂(HDACi)能够通过抑制HDAC6的活性而增强α-微管蛋白乙酰化使微管稳定,有利于紫杉醇的优先结合,进而增强紫杉醇的抗肿瘤性；6.我们的实验研究为乳腺癌的临床化疗方案的选择提供了新的思路和实验基础。