TMC(transmembrane channel-like gene)家族是一组跨膜离子通道样蛋白基因家族,该家族基因在哺乳动物呈保守性表达,但一直以来其功能却不为人知。直到2012和2013年的研究报道TMC1和TMC2是表达于耳蜗毛细胞的机械敏感性离子通道,参与听觉感觉的发生。我们的初步实验发现TMC7蛋白在外周感觉神经节DRG(dorsal root ganglion)中有较高水平的表达。故我们推测TMC7基因有可能参与感觉神经元感受对外界环境刺激的感知。为了进一步验证TMC7基因的功能,本论文首先从整体动物基因敲除TMC7基因入手,通过行为学实验观察基因敲除动物的表型改变。包括以高架十字迷宫、旷场实验、转棒实验为代表的运动行为学实验;以Von Frey纤维和热辐射刺激实验、ABR(auditory brainstem response)和DP(DPOAE)实验为代表的感觉行为学实验;以强迫游泳、水迷宫、癫痫模型为代表的高级神经活动行为学实验,对TMC7敲除大鼠的表型进行了初步的鉴定。发现TMC7敲除的大鼠的刺痛阈值明显降低,听觉能力在中高频率有明显降低。然后,我们通过Basescope和qPCR等多种方法对筛选出的表型相关组织TMC7的表达进行了验证,发现TMC7在DRG和耳蜗螺旋神经元中有很高的表达。最后,我们通过比较TMC7敲除大鼠和野生大鼠螺旋神经元的兴奋性,初步断定TMC7在调节螺旋神经元膜电位和兴奋性方面有一定功能,从而为接下来的研究奠定了基础。第一部分多种行为学方法探究TMC7敲除大鼠神经系统表型目的:通过对TMC7基因敲除大鼠与同窝对照野生大鼠多种神经系统行为表型的探究,确定TMC7基因敲除对大鼠行为学的影响,为下一步研究确定方向。方法:高架十字迷宫、旷场实验、转棒实验;Von Frey纤维和热辐射刺激实验、ABR实验和DP实验;强迫游泳、水迷宫实验、癫痫诱发实验。统计学方法t检验,Mann-Whitney U检验。结果:1.通过高架十字迷宫实验、旷场实验、转棒实验,对大鼠探索能力、运动能力、耐力和平衡能力进行评估。结果显示TMC7敲除鼠及野生鼠间没有统计学差异。2.运用Von Frey纤维刺痛针和热刺痛仪分别测量敲除大鼠的刺痛和热痛的基础阈值,结果显示敲除大鼠的刺痛阈值有明显的降低。3.运用ABR听力测试仪分别给予不同频率和分贝声音刺激,测量大鼠脑干反应,发现TMC7敲除鼠的听力在中高频率波段有明显的降低。而通过用来反映毛细胞功能得DP实验,未发现有明显的统计学差异。提示TMC7基因敲除可能对听觉初级感觉神经元(螺旋神经元)的功能产生较大影响。4.通过强迫游泳实验检测大鼠的绝望抑郁行为,发现TMC7敲除大鼠及野生大鼠间并没有明显的统计学差异。通过比较水迷宫实验中大鼠穿梭平台次数,发现TMC7敲除大鼠及野生大鼠的学习记忆能力没有受到明显影响。5.通过电刺激诱发癫痫实验,发现TMC7敲除大鼠和野生大鼠的癫痫潜伏时间和癫痫持续时间没有明显差别。第二部分TMC7在螺旋神经元的表达及对其与兴奋性影响的初探目的:通过qPCR和Basescope方法确定TMC7 m RNA在螺旋神经元中的表达情况;初步研究比较WT大鼠和TMC7基因敲除对螺旋神经元膜电位和兴奋性的影响。方法:qPCR技术,Basescope检测RNA技术,全细胞膜片钳技术。结果:1.取野生型大鼠的耳蜗组织,通过qPCR技术观察TMC7表达情况,结果显示TMC7在耳蜗中有较高的表达;进一步使用Basescope技术发现TMC7在螺旋神经元中明确的表达。2.通过全细胞膜片钳技术分别记录和比较TMC7敲除大鼠和野生的兴奋性。发现TMC7敲除大鼠耳蜗的APEX部位螺旋神经元膜电位没有明显变化,而BASE部位螺旋神经元膜电位表现为超极化趋势;两处神经元细胞兴奋性没有明显变化。结论:1.敲除大鼠的刺痛阈值有明显的降低2.听觉能力在中高频率波段表现出严重的丧失。3.TMC7在耳蜗螺旋神经元中高表达,其可能在调节BASE部位螺旋神经元的膜电位发挥重要功能,进而影响高频听力的传导。