背景与目的大肠癌是全球高发的恶性肿瘤之一。全世界每年大约有100万新发病例,每年至少50万患者死亡。男性患者的发病率远高于女性。西方国家大肠癌的发病率较高。在中国,大肠癌发病率也呈现逐年上升趋势。大肠癌的耐药,早期复发和转移是导致其预后差,病死率居高不下的重要因素。因此,阐明大肠癌的发病机制,寻找根治大肠癌的特异性靶点,增强基础放化疗疗效,对大肠癌的治疗至关重要。在肿瘤的研究过程中,人们发现并非所有的肿瘤细胞均可发展为新的肿瘤,只有小部分具有自我更新和强致瘤能力的肿瘤细胞才可发展成为新的肿瘤,这些细胞被称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞学说的提出在肿瘤研究史上具有里程碑式的意义,该学说颠覆了人们对肿瘤认识的传统观念。目前已在多种肿瘤中证实了肿瘤干细胞的存在,如乳腺癌、恶性胶质瘤、结直肠癌、前列腺癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌等。肿瘤的恶性生物学行为,如浸润、侵袭、转移及放化疗耐受,可能均与肿瘤干细胞有关。因此,针对大肠癌的研究热点也集中在对大肠癌干细胞的研究上。目前对大肠癌干细胞作用的分子机制研究才刚刚起步,相关的报道很少。大肠癌干细胞之所以具有独特的生物学特征,归根结底是与其特殊的基因表达有关。因此分析大肠癌干细胞的基因表达谱,探究其可能影响的细胞信号转导通路,对研究大肠癌干细胞的作用机制及寻找根除大肠癌干细胞的潜在靶点至关重要。材料与方法1.大肠癌组织标本收集收集74例外科手术切除的大肠癌标本,均征得患者知情同意,且标本均系术后病理学证实诊断为大肠癌。新鲜手术切除组织标本分别行两种方法预处理：置入组织保存液,-80℃低温冰箱保存；常规10%中性福尔马林固定。2.免疫组织化学方法检测大肠癌组织标本中CI)133蛋白表达及MAPK信号通路相关蛋白(ERK、p38、JNK及其磷酸化蛋白)的表达组织脱水、透明、浸蜡、包埋、制片、脱蜡、水化、抗原修复、分别与一抗和二抗结合反应、DAB显色、苏木素复染、切片脱水、透明及封片。最后采用半定量方法对组织化学染色进行评分。3.大肠癌细胞系培养6种大肠癌细胞株(SW480、Colo205、SW620、Lovo、HCT116、HT29)在含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基中培养。4.流式检测CD133+细胞所占比例(1)检测各种大肠癌细胞株CD133+细胞所占比例收集约106个细胞,标记PE—CD133/1单克隆抗体,空白对照组标记PE-同源IgG单克隆抗体,洗涤后上机检测；(2)检测经过免疫磁珠分选后的细胞中CD133+细胞的纯度,方法同上,但使用的抗体为针对细胞上另一CD133表位的PE-CD133/2单克隆抗体。5.免疫磁珠分选CD133+大肠癌干细胞将分选柱置于强而稳定的磁场中,加入CD133磁珠标记好的细胞进行分选,被磁性标记的细胞滞留在柱内,而未被标记的细胞则流出,洗脱滞留在柱内的CD133+细胞。二次过柱分选即将经过第一次分选后的CD133+细胞按照之前的操作,重新过柱分选一次。6.CD133+大肠癌干细胞培养分选后的细胞置于含B27(1：50)、EGF(20ng/ml)及bFGF(10ng/ml)的DMEM/F12无血清培养体系中培养,短时低速离心富集较纯的大肠癌干细胞球。待细胞球生长至75-100μm时进行消化分离,传代培养,稳定培养一周后用于NOD/SCID小鼠致瘤试验。7. NOD/SCID小鼠皮下移植瘤试验将相同数量(104个)CD133+细胞和CD133细胞分别皮下注射至小鼠左侧和右侧腹部,观察肿瘤在小鼠体内的生长情况,以比较两群细胞的致瘤能力。8.基因芯片分析CD133+细胞与CD133-细胞的基因表达谱分别抽提两种细胞群的总RNA样本,质检合格后,制备芯片,经过杂交、洗脱、染色、检测、芯片图像采集及数据分析得到差异表达的基因。通过MAS平台对差异基因的功能和相关信号通路进行分析。9. QRT-PCR法检测基因mRNA表达分别抽提两种细胞群的总RNA样本,合成cDNA,置QRT-PCR反应仪中定量分析p53、AKT1、TGFBR2、ABCB6、CDC2、CHEK1、CHKN1A和CCNB1基因的mRNA表达水平。10. Western Blot方法检测蛋白表达分别抽提两种细胞群总蛋白样本,测定蛋白浓度,蛋白变性、蛋白上样电泳、转膜、封闭、分别与一抗和二抗结合反应、最后ECL化学发光法检测并半定量分析ERK1/2、磷酸化ERK1/2、JNK、磷酸化JNK、p38、磷酸化p38、磷酸化p53、磷酸化cdc-2、磷酸化Chkl(Ser68)、磷酸化Chkl(Tyr68)、磷酸化Rb(Ser795)及磷酸化Rb(Ser807/811)蛋白在两种细胞群中的表达。11.统计学分析计量资料以x±SD表示,计数资料以百分比(%)表示。所有结果采用SPSS13.0软件进行统计学分析。分别运用Mann-Whitney检验及Kmskall-Wallis检验分析CD133的表达强度与大肠癌病理特征的关系。多组率的比较采用One-Way ANOVA统计方法。运用两独立样本T检验分析比较目的基因表达水平。以P<0.05(双侧检验)认为结果具有统计学意义。结果1.大肠癌组织中CD133的表达情况74例结直肠癌标本中25例CD133阳性表达,阳性率为33.8%,共有8例(8/25,32.0%)CD133表达呈强阳性。CD133阳性表达的肿瘤组织相应的癌旁组织中CD133表达缺失。CD133表达强度在不同性别、年龄、部位及肿瘤病理分型的差异均无统计学意义(P>0.05)。除粘液腺癌外CD133在高、中、低分化腺癌中的表达率分别为15.4%(2/13),33.3%(12/36)及58.8%(10/17),差异显著(P<0.05),其中CD133在低分化的肿瘤组织中表达率最高。CD133在各期结直肠癌中的表达率分别为,Ⅰ期15.4%(2/13)；ⅡⅡ期40.0%(12/30)；Ⅲ期19.0%(4/21)；Ⅳ期70.0%(7/10),差异具有统计学意义(P<0.05),其中CD133在Ⅳ期大肠癌患者中表达阳性率最高。此外我们还发现CD133在转移性大肠癌组织中的表达率高于其在未发生转移的大肠癌组织中的表达,差异具有统计学意义(P<0.05)·。CD133在低分化肿瘤、ⅣV期肿瘤即发生远处脏器转移的大肠癌中表达强度明显升高。2.6种大肠癌细胞株中CD133+细胞所占比例流式细胞技术检测结果提示SW480、SW620及Lovo细胞株中CD133+细胞所占比例较高,而在其它3种大肠癌细胞株中CD133+细胞所占比例较低。其中SW480细胞株中CD133细胞所占比例最高,为0.916%。3.分选后大肠癌细胞中CD133+细胞所占比例SW480细胞经过一次过柱分选后,CD133+细胞比例约为30%,但经过二次过柱分选后,CD133+细胞比例已超过80%,该试验重复两次均得到相似的结果。4.CD133+细胞的扩增培养CD133+细胞在无血清培养体系中呈悬浮生长,初始为单细胞生长,第2—3天,大部分细胞开始扩增成团状,但仍有部分细胞死亡崩解,皿底可见细胞碎片。第5天,细胞持续扩增,所形成的细胞球逐渐增大,球内细胞折光性好,结构紧密,形态圆,细胞形态不可见,不能准确区分细胞与细胞间界限。待细胞球生长至75—100μm大小时进行传代,随着传代次数的增加,球体大小逐渐均一,趋于圆形。将这些细胞重新至于含血清培养基中1天后多数细胞逐渐贴壁生长,3天左右可见细胞形成单层细胞贴壁生长。5-CD133+细胞较CD133细胞致瘤性更强NOD/SCID小鼠左右侧胁腹部皮下分别注射相同数量(104)CD133+细胞和CD133-细胞,2周后在左侧腹部(注射CD133+细胞的部位)可见肿瘤生长,3—4周肿瘤大小已大于lcm。而在右侧腹部(注射CD133细胞的部位)未见肿瘤生长。6.CD133+细胞的基因表达谱通过基因芯片共检测了21522个基因,发现CD133+细胞和CD133-细胞共有414个差异表达的基因。其中CD133+细胞表达上调的基因共185个,CD133+细胞表达下调的基因共229个。差异表达的基因主要包括,多梳蛋白家族成员BMI1,其在CD133+细胞中表达上调,可能参与并参与维持大肠癌干细胞的自我更新：多数ABC转运蛋白也在CD133+细胞中表达上调,如ABCB6、ABCC2、ABCA7和ABCF3等,可能与大肠癌的耐药有关；CD133+细胞中还表达高水平抗凋亡基因,如IRF-3、IRF-7及DAPK3,推测大肠癌干细胞可能通过相关的信号传导通路发挥其抗凋亡作用。这些基因直接或间接与肿瘤干细胞的恶性生物学特征有关。7.差异基因功能分析CD133与CD133-细胞样本中与生物过程相关的差异表达基因占55.6%,其中包括：转录调节、细胞周期、有丝分裂、转录、细胞分裂、蛋白氨基酸磷酸化等功能；与细胞组成相关的差异表达基因占16.1%,包括细胞核、细胞质、胞质溶胶、细胞膜、细胞膜整体性构成、胞质膜及线粒体构成等；与分子功能相关的差异表达基因占28.3%,包括：蛋白结合、核酸结合、转移酶活性、ATP结合、锌离子束缚、GTP结合及转录因子活性等。8.差异基因与信号通路的相关性分析CD133+与CD133-细胞样本间表达差异的基因主要分布于细胞周期信号通路、p53信号通路、紧密连接信号通路、神经胶质瘤信号通路、胰腺癌信号通路、钙信号通路、胰岛素信号通路、前列腺癌信号通路、蛋白酶信号通路、促性腺激素释放激素及促分裂原活化蛋白激酶等多种重要信号通路。其中在差异表达的基因中分别有6个基因参与p53信号通路(CDKNIA、CCNB1、CHEK1、PMAIP1、CCNG1及CDC2)及MAPK信号通路(TGFBR2、AKT1、PLA2G4B、JMJD7-PLA2G4B、CACNA2D2、RRAS2及RAP1A)。9. QRT-PCR验证芯片结果通过QRT-PCR精确定量检测方法判断基因芯片结果的可靠性。8种相关目标基因的验证结果为,p53、AKTl、TGFBR2和ABCB6基因在CD133+细胞中的表达较其在CD133-细胞中表达升高,差异具有统计学意义(P<0.05)；余4种基因CDC2、CHEK1、CHKNIA和CCNB1在CD133+细胞中表达下调,统计分析提示上述基因在两种细胞的表达差异显著(P<0.05)。8种目标基因的表达上调或下调的变化趋势与基因芯片结果基本一致,证明基因芯片结果真实可靠。10.CD133+与CD133-细胞中MAPK信号通路相关蛋白的表达CD133+与CD133-细胞中ERK1/2、JNK及p38蛋白的表达无明显差异。但在CD133+细胞中磷酸化ERK1/2和磷酸化p38蛋白的表达较CD133-细胞明显增加,但磷酸化的JNK蛋白在两群细胞中的表达无明显改变。大肠癌组织中免疫组化染色结果显示ERK蛋白在CD133阳性表达和CD133阴性表达的组织中均呈阳性表达；CD133阳性表达的大肠癌组织中可见磷酸化ERK蛋白呈弱阳性表达,而在CD133表达缺失的大肠癌组织中未见磷酸化ERK蛋白的表达。p38蛋白在CD133阳性大肠癌组织中呈阳性表达,其中部分样本中p38蛋白呈强阳性表达,而在CD133表达缺失的肿瘤组织中,p38蛋白呈现弱阳性表达或表达缺失。所有检测样本中均未检测到JNK蛋白及其相应的磷酸蛋白的表达。11.CD133+与CD133-细胞中p53信号通路相关蛋白的表达p53信号通路相关蛋白,包括磷酸化p53蛋白、磷酸化cdc-2蛋白、磷酸化Chkl(Ser68)、磷酸化Chkl(Tyr68)、磷酸化Rb(Ser 795)及磷酸化Rb(Ser807/811)蛋白,6种蛋白在CD133+细胞中的表达均受到抑制。结论1.CD133表达与大肠癌的临床病理特征相关CD133的表达与大肠癌TNM分期和转移直接相关,在一定程度上能预示结直肠癌的恶性程度,也间接说明大肠癌干细胞参与了大肠癌的发生和演进,并可能在其中发挥关键作用。2.CD133可作为大肠癌干细胞的筛选标志分选后CD133+细胞在无血清培养体系中的生长特点符合肿瘤干细胞的特性,并具有一定的分化能力。动物实验证实CD133+大肠癌细胞富集了未分化的大肠癌干细胞,具有很强的增殖能力。而CD133细胞则大部分为已分化肿瘤细胞,增殖能力有限,因而致瘤性差。由此我们可以推测,大肠癌干细胞可能是启动小鼠肿瘤生长的根基。3.大肠癌干细胞具有与普通大肠癌细胞完全不同的基因表达谱两种细胞间差异表达的基因涉及多种功能蛋白和代谢通路。提示大肠癌干细胞之所以具有独特的恶性生物学行为,其分子机制错综复杂。4. MAPK和p53信号通路与大肠癌的相关性大肠癌干细胞可能通过激活MAPK信号通路,抑制p53信号通路发挥其增殖、分化、抗凋亡、耐药等恶性生物作用。p53和MAPK信号通路可能与大肠癌干细胞的发生和演进有关,有望成为彻底根除大肠癌干细胞的潜在靶点。