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寡聚化结构域Foldon介导的目标酶寡聚化可以提高酶催化性能,同时也能提高类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides,ELP)分离纯化目标酶的得率,是一种简单易行的酶性能改造方法。但Foldon间非共价键的结合在高温下易解聚,影响目标酶催化性能的提升。为此,本课题通过在Foldon中适当位置引入Cys,通过多肽链间的二硫键连接提高其在高温下的稳定性,以拓展Foldon在嗜热酶催化性能提升中的应用。其次,为了探索蛋白质复性的新方法,对环化酶在不同变性条件下的复性效率进行了研究。得到如下研究结果:(1)通过对Foldon结构分析,将其第8位精氨酸和第18位甘氨酸全部替换为半胱氨酸,构建了基于共价键连接的寡聚化ELP-Foldon(E-Fm),经实验证明E-Fm单体之间能成功形成二硫键。随后构建了线性地衣多糖酶(B-E,该酶为常温酶)、非共价寡聚地衣多糖酶(B-E-F)和共价寡聚地衣多糖酶(B-E-Fm)并进行分离纯化,其最适反应温度均为45℃;最适反应pH为7.0;其中B-E-F在40℃开始发生解聚,B-E-Fm则在70℃才开始发生解聚;其动力学研究表明,在55℃以下,B-E-F和B-E-Fm催化效率明显优于B-E,并且B-E-Fm催化效率最高,在60℃时由于酶活力损失严重,不同拓扑结构地衣多糖酶催化效率均明显下降。(2)为了进一步考察共价连接的Foldon对嗜热酶的催化性能提升效果,选用GH11家族的嗜热木聚糖酶X11A进行研究,成功构建了线性木聚糖酶(X11A-E)、非共价寡聚木聚糖酶(X11A-E-F)和共价寡聚木聚糖酶(X11A-E-Fm)并进行分离纯化。研究得出X11A-E最适反应温度为60℃,X11A-E-F和X11A-E-Fm最适反应温度为55℃;最适反应pH均为7.0;其动力学研究表明,X11A-E-F在温度达到60℃时,催化效率与X11A-E趋于一致。然而,X11A-E-Fm在60-65℃依然能保持相比于X11A-E更高的催化效率。结果证明,共价连接的Foldon能使嗜热酶在高温下的催化效率得到提高。(3)此外,通过对不同变性条件下线性地衣多糖酶(B-E)和环化地衣多糖酶(cB-E)的研究发现,随着有机溶剂极性的增加,酶活力损失越严重。其中,甲醇、苯甲醇、丙酮和1 mol/L HCl能使B-E和cB-E在短时间内变性失活;乙腈、乙醇、正丁醇和乙二醇对酶活力分别有不同程度的影响;异丙醇对酶活力几乎没有影响,1 h后还能保持90%以上的酶活力。复性结果分析可得,经甲醇变性后B-E和cB-E都无法复性,而乙醇、乙腈、异丙醇和正丁醇变性后B-E和c B-E都能复性。有趣的是经苯甲醇、丙酮和1 mol/L HCl变性后,B-E无法复性,而c B-E却能在10 min之内迅速恢复80%以上的酶活力。上述研究证实,经合理设计所得共价连接的Foldon通过寡聚化实现了嗜热酶催化性能的提高,在嗜热酶活性改造领域具有应用潜力。此外,通过对蛋白质进行环化设计,有望建立一个全新的、通用的变性蛋白质复性方法,为蛋白质复性提供新思路。