研究背景糖尿病·性心肌病以心肌重构和心功能下降为特征,最终导致心力衰竭和死亡。己证实高血糖诱导的氧化应激和炎症参与糖尿病性心肌病的发病过程。心肌纤维化、心肌肥厚和心肌细胞凋亡被认为是糖尿病性心肌病左室重构的3个主要病理特征。预防和延缓左室重构可改善糖尿病性心肌病的长期临床预后,因此防治左室重构己成为治疗的首要目标。大量证据证实肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)在糖尿病性心肌病的发病过程中起重要作用。血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme, ACE)、血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2, ACE2)、血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)和血管紧张素(1-7)[angiotensin-(1-7), Ang-(1-7)]是RAS的重要组成成分。以往研究证明,应用ACE抑制剂和血管紧张素Ⅱ1型受体(angiotensin Ⅱ type1receptor,AT1R)拮抗剂阻断RAS能明显改善左室重构和功能障碍。在心肌成纤维细胞内ACE抑制剂可阻断ACE催化的Ang-Ⅱ生成,但在心肌细胞内对糜蛋白酶催化的Ang-Ⅱ生成无影响。另一项研究显示,AT1R拮抗剂仅对细胞外Ang-Ⅱ有抑制作用:而细胞内Ang-Ⅱ也是糖尿病性心肌病中胶原合成的生要递质。因此,ACE抑制剂或AT1R拮抗剂仅能部分阻断糖尿病性心肌病中增强的的RAS活性。最近Zhong等报道,Ang-Ⅱ诱导几室纤维化、肥厚及舒张功能异常；ACE2基因敲除可加重这些异常；而重组人ACE2可减轻这些异常,同时降低血浆及心肌中,Ang-Ⅱ水平并提高血浆Ang-(1-7)水平。我们最近的研究发现,心肌局部ACE2过表达可通过降低心肌Ang-Ⅱ水平和提高心肌Ang-(1-7)水平显著抑制糖尿病性心肌病大鼠左室间质胶原的沉积,改善左室重构和功能。这些研究表明,Ang-(1-7)有希望成为治疗糖尿病性心肌病的新型药物。Ang-(1-7)是Ang-Ⅱ在ACE2催化下生成的七肽,通过与Mas受体(Mas receptor,MasR)结合发挥舒张血管、抗增殖和抗炎等作用。Ang-(1-7)亿体内的半衰期约为9～10秒,仅为Ang-Ⅱ(45秒)的1/4～1/6。在高血压、心肌梗死等诱导的心肌重构动物模型中,Ang-(1-7)被证实具有一定的保护作用,但尚缺乏其剂量-效应关系的研究证据,亦未见有关Ang-(1-7)毒性作用的研究报告。我们近期的研究发现,ACE2过表达可降低AT1R表达,提示ACE2/Ang-(1-7)的作用机制可能涉及MasR以外的受体。因此,下列几个重要的科学问题亟待明确：(1)Ang-(1-7)干预糖脲病性心肌病的剂量-效应关系如何(2)Ang-(1-7)干预糖尿病性心肌病是否优于ACE抑制剂?(3)Ang-(1-7)和ACE抑制剂联合应用是否优于单一用药?(4)AT1R、血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ type2receptor,AT2R)和MasR在Ang-(1-7)(?)心肌保护作用中分别起到什么作用?研究目的本研究旨在验证以下假说:(1)长期应用Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地改善糖尿病性心肌病大鼠的左室重构和功能：(2)联合应用Ang-(1-7)和ACE抑制剂干预优于单一药物干预;(3)Ang-(1-7)(?)的心肌保护作用由MasR和AT2R共同介导;Ang-(1-7)与MasR和AT2R结合后可下调AT1R并上调AT2R。研究方法动物模型将126只雄性Wistar人鼠随机分为模型组(112只)和正常对照组(14只)。通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导模型组大鼠产生糖尿病。在12周末将存活的模型组大鼠随机分为8组：模型组、培哚普利组、低剂量Ang-(1-7)组、中剂量Ang-(1-7)组、高剂量Ang-(1-7)组、高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组、高剂量Ang-(1-7)+A779组和高剂量Ang-(1-7)+PD123319组。血压和心率测量应用tail-cuff法测量尾动脉收缩压、舒张压、平均动脉压和心率。心脏超声和血流动力学测定应用心脏超声和Millar微导管评价大鼠左室功能。血液生化指标检测利用Bayer1650血生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯和血糖水平。组织学分析制备厚度为4μm的石蜡切片,用于H＆E和Masson染色以评价左室形态和间质及血管周围纤维化程度。透射电镜取岀心脏后,立即将新鲜左室壁切成1mm3的小块,为在透射电镜下观察超微结构做准备。实时定量RT-PCR利用实时定量RT-PCR测定基因ImRNA水平,用2-△△cT法定量mRNA相对水平。β-actin基因用作内参基因。原代大鼠心肌成纤维细胞和心肌细胞的分离和培养利用刚岀生,1-2天的Wistar大鼠的心脏分离和培养左室心肌成纤维细胞和心肌细胞。3H脯氨酸掺入实验利用3H脯氨酸掺入实验测定心肌成纤维细胞合成胶原的能力。明胶酶谱法利用明胶酶谱法测定心肌成纤维细胞内基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase2, MMP-2)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase9, MMP-9)的活性。酶联免疫吸附试验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA)利用ELISA利用测定心肌成纤维细胞培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ及转化生长因子β1(transforming growth factor-beta1, TGF-β1)的水平；测定大鼠心肌中Ang-(1-7)的水平；测定心肌成纤维细胞、心肌细胞和人鼠左室中Ang-Ⅱ的水平。心肌细胞肥大的测定Alexa Fluor(?)488标记的麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色测定心肌组织中心肌细胞的横截面积；利用肌球蛋白重链(myosin heavy chain, MYH)的兔多克隆抗体免疫组织化学染色测定原代心肌细胞的表面积。凋亡的检测和定量利用TUNEL法测定左室心肌细胞的凋亡率;利用MYH和TUNEL免疫荧光双标染色测定原代心肌细胞凋亡率。二氢乙锭染色和光泽精增强化学发光实验利用氧化荧光染料二氢乙锭测定左室冰冻切片和原代心肌成纤维细胞及心肌细胞中超氧阴离子(O2-)的水平。利用光泽精增强化学发光法检测心肌组织和原代心肌成纤维细胞及心肌细胞中NADPH氧化酶的活性。Western Blot、免疫组织化学和免疫细胞化学Western Blot、免疫组织化学和免疫细胞化学分析按标准步骤进行。统计学分析利用SPSS v11.54(?)条件处理数据,连续型变量以平均数±标准误表示。利用单因素方差分析和Tukey-Kramer post hoc检验比较多组间的连续型变量。两组间比较选择非配对t检验。利用(?)Kaplan-Meie生存分析和(?)og-rank(?)检验评价各组大鼠的生存率。当P<0.05时认为差异有统计学意义。研究结果Ang-(1-7)剂量依赖性地抑制左室纤维化、心肌肥厚和心肌细胞凋亡,从而改善糖尿病性心肌病大鼠的左室重构和心功能障碍。其分子机制制及炎症、氧化应激及胶原合成的下调、ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化及TGF-β1的表达爱抑制以及MasR、AT1R及AT2R之间的复杂相互作用。另外在左室心肌保护方面,Ang-(1-7)和培哚普利联合干预优于单一药物干预。Ang-(1-7)对糖尿病大鼠血脂和血糖水平无明显影响STZ注射1周后,模型组大鼠空腹血糖显著升高持续至实验结束。与之相似,模型组大鼠血清总胆因醇和甘油三酯水平明显高于正常对照组。在16周末血清总胆固醇、甘油三酯和血糖水平在模型组和各干预组间无明显差异。各干预组未观察到明显的不良反应。Kaplan-Meie生存分析显示,各组大鼠之间生存率亦无显著差异Ang-(1-7)改善糖尿病大鼠的左室功能障碍STZ注射12周后,与正常对照组相比,模型组人鼠左室射血分数(leftVentricular ejection fraction,LVEF).缩短分数(fractional shortening, FS). E/A、E’/A’、左室最大收缩压(left ventricular systolic pressure,LVSP)和左室压力上升及下降最大速率(±dp/dt绝对值)均降低,而左室舒张末期直径(left ventricular end-diastolic diameter, LVEDD)和左室舒张末期压力(left ventricular end-diastolic pressure,LVEDP)均升高。Ang-(1-7)干预4周可剂量依赖性地改善以上参数,且其作用具有剂量依赖性；联用MasR拮抗剂A779或AT2R拮抗剂PD123319可阻断Ang-(1-7)的上述作用。培哚普利单独干预显著提高糖尿病大鼠的E’/A和±dp/dt绝对值；显著降低LVEDD和LVEDP:对其余参数影响不明显。与模型组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠的LVEF、FS、E/A、E’/A’. LVSP和±dp/dt绝对值均显著升高,而LVEDD和LVEDP均显著降低。与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+(?)(?)哚普利组大鼠的E/A、E’/A’、LVSP和±dp/dt绝对值均显著升高,LVEDD和LVEDP均显著降低,LVEF和FS升高,但无统计学意义。与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠的E/A和-dp/dt绝对值均显著升高,其余参数变化不明显。高剂量Ang-(1-7)组大鼠的LVSP显著高于培哚普利组,LVEDD显著低于培哚普利组,其余参数无显著性差异。Ang-(1-7)(?)(?)大鼠血压和心率无明显影响。培哚普利单独干预或与高剂量Ang-(1-7)联合干预均显著降低糖尿病大鼠的收缩压、舒张压和平均动脉压,对心率亦无明显影响。Ang-(1-7)(?)(?)轻糖尿病大鼠的左室肥厚与正常对照组相比,模型组大鼠室间隔厚度(intraventricular septal thickness,IVSth)、左室后壁度(left ventricular posterior wall thickness, LVPWth)和心脏重量与体重的比值(heart weight/body weight, HW/BW)均显著升高。Ang-(1-7)剂量依赖性地降低IVSth、LVPWth和HW/BW。联用Ang-(1-7)和培哚普利进一步降低这些参数。Ang-(1-7)对心肌肥厚的作用可被PD123319或A779联用所阻断。模型组心肌细胞横截面积明显大于正常对照组,提示糖尿病性心肌病人鼠存在心肌肥厚。Ang-(1-7)剂量依赖性地降低心肌细胞横截面积,这一作用被培哚普利联用所增强,被PD123319或A779联用所阻断。与之相同,心肌肥厚标记物脑钠肽和β肌球蛋白重链的mRNA表达均可被Ang-(1-7)干预剂量依赖性地降低,这一作用可被培哚普利联用增强、被PD123319联用完全阻断并被A779联用部分阻断。因此,Ang-(1-7)通过结合AT2R和MasR阻断粮尿病心肌肥厚的进展。Ang-(1-7)抑制糖尿病大鼠的左室纤维化与正常对照组相比,模型组大鼠左室胶原分数(collagen volume fraction, CVF)和血管周围胶原面积与管腔面积的比值(the ratio of perivascular collagen area to luminal area,PVCA/LA)分别升高2.9和3.1倍。Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低CVF和(?)PVCA/LA。另外,与单一药物干预相比,Ang-(1-7)(?)(?)培哚普利联合干预显著降低CVF和PVCA/LA。然而,Ang-(1-7)对CVF和PVCA/LA的作用可被A779完全阻断,并被PD123319部分阻断。与模型组相比,Ang-(1-7)可剂量依赖性地降低纤维化相关基因如纤维连接蛋白-1、胶原Ⅰ α1、胶原Ⅲα1和TGF-β1的mRNA表达以及胶原Ⅰ α1与胶原Ⅲα1的mRNA比值。在培哚普利组可观察到相同作用。另外,Ang-(1-7)(?)的作用可被A779完全阻断,并被PD123319部分阻断。免疫组化结果提示,与正常对照组相比,模型组胶原Ⅰ、Ⅲ组胶原Ⅰ、Ⅲ含量和比值均显著升高;与模型组相比,Ang-(1-7)干预剂量依赖性地降低胶原Ⅰ含量和胶原Ⅰ/Ⅲ,而对胶原Ⅲ含量无影响。Ang-(1-7)对胶原Ⅰ表达的抑制作用可被A779完全阻断,并被PD123319部分阻断。为探讨Ang-(1-7在心肌纤维化中的作用机制，将左室组织切片进行S100A4和α-SMA免疫荧光双标染色,S100A4标记成纤维细胞而α-SMA标记肌成纤维细胞。与正常对照组相比,模型组间质S100A4阳性染色面积、α-SMA阳性染色面各和(?)α-SMA/S100A4均明显升高,而Ang-(1-7)或培哚普利干预可降低这些参数。Ang-(1-7)(?)的这些作用可被A779完全阻断,并被PD123319部分阻断。另外,Ang-(1-7)可剂量依赖性地抑制ERK1/2和p38-MAPK和激活以及TGF-β1的表达,该作用同样可被A779完全阻断,并被PD1233197部分阻断。Ang-(1-7)改善糖尿病大鼠的左室形态和超微结构异常大鼠左室组织(?)H&E染色显示糖尿病引起肌纤维排列紊乱、断裂及弥漫性纤维化：透射电镜显示正常大鼠左室心肌细胞肌节和Z线清晰、线粒体大小及数量正常,而模型组大鼠肌原纤维排列紊乱.半线粒体显著肿胀及破坏。这些改变可被Ang-(1-7)剂量依赖性地改善；亦可被培哚普利单独F预所改善；高剂量Ang-(1-7)和培哚普利联合干预对左室形态和超微结构的改善作用更明显。Ang-(1-7)对糖尿病诱导的左室形态和超微结构异常的保护作用可被A779或PD123319部分阻断。Ang-(1-7)抑制糖尿病大鼠的左室心肌细胞凋亡模型组大鼠心肌细胞凋亡增加,表现为TUNEL阳性细胞比例升高、透射电镜下心肌细胞核形态异常、Ba×的mRNA和蛋白水平升高、Bax/Bcl-2比值升高和Bcl-2的mRNA和蛋白水平下降。上述改变可被Ang-(1-7)剂量依赖性地改善,Ang-(1-7)在800nq·kq-1·min-1剂量时可明显改善心肌细胞核的特征；培哚普利单独干预可显著降低Bax的蛋白水平和Bax与Bcl-2的mRNA和蛋白比值,显著提高Bcl-2的蛋白水平,而对TUNEL阳性细胞比例以及Bax和Bcl-2的mRNA水平无明显影响；培哚普利组与高剂量Ang-(1-7)组间无明业差异；与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组中(?)TUNEL阳性细胞比例、Bax的mRNA和蛋白水平、Bax与Bcl-2的mRNA和蛋白比值均显著下降,Bcl-2的mRNA水平显著升高,而Bcl-2蛋白水平无显著升高；与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠左室内Bax的蛋白水平以及Bax与Bcl-2的蛋白比值显著降低,而其余参数无明显改变。Ang-(1-7)对心肌细胞凋亡的抑制作用可被PD123319完全阻断,并被A779部分阻断。Ang-(1-7)减轻糖尿病大鼠的左室氧化应激和炎症与正常对照组相比,模型组大鼠左室O2-含量和NADPH氧化酶活性均升高。Ang-(1-7)可剂量依赖性地减轻左室氧化应激,Ang-(1-7)与培哚普利联用则使氧化应激恢复至正常水平。Ang-(1-7)对左室氧化应激的作用可被A779或PD123319联用所减轻。免疫组化结果,显示,模型组人鼠左室IL-1β、IL-6和MCP-1(?)的表达显著高于正常对照组。Ang-(1-7)(?)(?)剂量依赖性地降低IL-1β、IL-6和MCP-1的表达；培哚普利单独干预可显著降低MCP-1,而对IL-1β和IL-6无明显降低作用；与培哚普利组相比,中、高剂量Ang-(1-7)(?)(?)左室内IL-6含量显著下降,而IL-1β和MCP-1含量无明显下降；与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组左室内IL-1β和IL-6含量显著下降,而MCP-1含量无明显降低;与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠左室内IL-1β、IL-6和MCP-1的含量均无明显改变。Ang-(1-7)抑制上述炎症因子表达的作用可被A779或PD123319联用所阻断。Ang-(1-7)抑制左室心肌成纤维细胞合成胶原高糖刺激显著升高心肌成纤维细胞培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ的含量和比值,高糖的这一作用可被Ang-(1-7)(?)时间和剂量依赖性地抑制。Ang-(1-7)(?)的抑制作用被培哚普利用增强,而被A779联用完全阻断。高糖刺激可使胶原合成提高2.2倍,该作用可被10-8mol/L Ang-(1-7)(?)(?)育72hr显著抑制,而联合应用Ang-(1-7)和培哚普利处理可进一步降低高糖诱导的胶原合成。高糖刺激可提高MMP-9活性,并降低MMP-2活性；Ang-(1-7)单独干预可轻微提高MMP-2活性,但无统计学意义;培哚普利音独干预预或与Ang-(1-7)联合干预可提高MMP-2活性,而对MMP-9活性无影响。Ang-(1-7)对胶原合成的抑制作用可被A779完全阻断。Ang-(1-7)抑制左室心肌成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化和氧化应激高糖刺激显著促进成纤维细胞增殖，表现为Ki67阳性细胞比例升高。另外,高粮促进心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞转化,表现为α-SMA阳性细胞占S100A4阳性细胞的比例升高。Ang-(1-7)处理72hr可显著降低Ki67阳性细胞的比例和(?)α-SMA阳性细胞的比例,这些作用可被A779完全阻断。与单一药物干预相比,联用Ang-(1-7)和培哚普利显著降低Ki67性细胞的比例和α-SMA阳性细胞的比例。高糖培养升高心肌成纤维细胞内O2-含量和NADPH氧化酶活性,而此作用可被Ang-(1-7)处理72hr减轻。Ang-(1-7)(?)(?)培哚普利联合处理可使心肌成纤维细胞内O2-含量和NADPH氧化酶活性恢复至正常水平。另外,Ang-(1-7)(?)减轻高糖诱导的心肌成纤维细胞氧化应激的勇力可被A779或PD123319部分阻断。Ang-(1-7)抑制左室心肌成纤维细跑内ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化及TGF-β1的表达高糖培养的心肌成纤维细胞内ERK1/2和p38-MAPK的磷酸化水平可被Ang-(1-7)处理明显降低,表明MAPK信号通路可能参与Ang-(1-7)对糖尿病性心肌病的保护作用。与之相同,Ang-(1-7)可降低TGF-β1的蛋白表达水平。Ang-(1-7)对ERK1/2、p38-MAPK和TGF-β1的作用可被A779或PD123319抑制,提示在心肌成纤维细胞中Ang-(1-7)通过结合MasR和AT2R抑制(?)JERK1/2和p38-MAPK的激活及TGF-β1的蛋白表达。左室成纤维细胞-左室心肌细胞交互作用促进胶原和TGF-β1的生成成纤维细胞+未处理心肌细胞组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平显著高于成纤维细胞组。而成纤维细胞+Ang-(1-7)处理心肌细胞组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平显著低于成纤维细胞+未处理心肌细胞组。成纤维细胞+未处理心肌细胞培养基组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平明显高于成纤维细胞组。而成纤维细胞+Ang-(1-7)处理心肌细胞培养基组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平显著低于成纤维细胞+未处理心肌细胞培养基组。Ang-(1-7)对成纤维细胞-心肌细胞交互作用诱导的胶原和TGF-β1生成的抑制作用可被A779或PD123319部分阻断。Ang-(1-7)通过结合(?)MasR和AT2R阻断左室心肌细胞的肥大、凋亡和氧化应激体外实验中,高糖刺激显著增大心肌细胞表面积,而Ang-(1-7)单独处理或与培哚普利联合处理可使其正常化。Ang-(1-7)的这一作用可被A779或PD123319阻l断。而单独应用A779或PDl23319均不能改变高糖培养的心肌细胞表面积。高糖刺激提高心肌细胞凋亡率,而Ang-(1-7)单独处理或培哚普利联合处理可部分抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡。Ang-(1-7)的这一作用可被A779或PD123319阻断。高糖刺激可提高心肌细胞内O2-含量和(?)NADPH氧化酶活性。Ang-(1-7)和／或培哚普利处理可使心肌细胞内O2-含量和NADPH氧化酶活性恢复至正常水平。另外,Ang-(1-7)(?)(?)轻高糖诱导的心肌细胞氧化应激的能力可被A779或PD123319阻断。Ang-(1-7)下调AT1R并上调AT2R4周的Ang-(1-7)干预显著提高了大鼠左室心肌内Ang-(1-7)水平,而培哚普利无此作用。与单用Ang-(1-7)相比,Ang-(1-7)与培哚普利联用能进一步提高左室Ang-(1-7)水平体内实验结果显示糖尿病模型组大鼠左室内AT1R表乏达显著高于正常对照组,而AT2R表达显著低于正常对照组:大剂量Ang-(1-7)干预可减轻糖尿病诱导的AT1R和AT2R的表达变化。体外实验中,在心肌成纤维细胞和心肌细胞中高糖刺激均可上调AT1R而下调AT2R,这些作用可被Ang-(1-7)处理抑制。然而,在体内和体外实验中Ang-(1-7)均不能显著改变MasR和Ang-Ⅱ的水平Ang-(1-7)对AT1R表达的抑制作用大鼠左室和原代心肌成纤维细胞中可被A779或PD123319完全阻断:在原代心肌细胞中可被A7791阻断,而不被PD123319阻断。Ang-(1-7)对AT2R表达的上调作用在大鼠左室中可被PD123319完全阻断,并被A779部分阻断：在原代心肌成纤维细胞中可被PD123319完全阻断,而不被A779阻断；亿原代心肌细胞中可被A779或PD123319完全阻断。研究结论(1)长期Ang-(1-7)输注可剂量依赖性地改善粮尿病性心肌病左室重构及收缩和舒张功能障碍。(2)Ang-(1-7)发挥心肌保护作用的细胞机制包括Ang-(1-7)减轻心肌成纤维细胞增殖和向肌成纤维细胞的转化;减轻心肌细胞线粒体肿胀、肌原纤维排列紊乱、肥大和凋亡；以及抑制成纤维细胞与心肌细胞间的交互作用。(3)Ang-(1-7)发挥心肌保护作用的分子机制包括Ang-(1-7)了调炎症因子表达、氧化应激及胶原合成：抑制(?)ERK1/2和p38-MAPK磷酸化及TGF-β1表达：下调AT1R并上调AT2R的表达；Ang-(1-7)的心肌保护作用由MasR和AT2R共同介导。(4)Ang-(1-7)与培哚普利联合应用可发挥更强的心肌保护作用。因此,本研究为糖尿病性心肌病的治疗提供了一种具有应用前景的新策略。研究背景糖尿病可激活肾素-血管紧张系统(renin-angiotensin system,RAS),升高心肌内血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)及其1型受体(angiotensin Ⅱ type1receptor,AT1R)的水平。升高的Ang-Ⅱ(?)了结合心肌成纤维细胞和心肌细胞表面的AT1R,促进心肌成纤维细胞增殖、向肌成纤维细胞转化、胶原代谢紊乱和心肌细胞肥大,导致左室重构和功能障碍。然而,尚未证实RAS可参与糖尿病性心肌病右室重构。血管紧张素转化酶(angiotensin-converting enzyme,ACE)抑制剂(?)AT1R拮抗剂可通过抑制过度激活的RAS(?)(?)善左室重构、左心衰竭并降低死亡率。然而,尚无证据显示这些治疗措施在右心衰竭中的效果。在以往的研究中,我们发现,RAS(?)的新成员血管紧张素转化酶2(angiotensin-convening enzyme2,ACE2)(一种锌金属蛋白酶)过表达可减轻1型糖尿病或急性心肌梗死诱导左室重构和功勇障碍,同时下调Ang-Ⅱ和上调血管紧张素(1-7)[angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]。此外,Johnson(?)(?)在右心室压力负荷诱导的小鼠模型中发现,重组人ACE2(?)预可减轻右室肥厚并改善右室收缩和舒张功能,其保护作用与细胞间交互作用有关Ang-(1-7)由包括ACE和ACE2在内的几种肽链内切酶和羧基肽酶催化Ang-Ⅰ和Ang-Ⅱ成,具有血管舒张、抗炎、抗增殖等生物活性。研究表明,内源性或外源性Ang-(1-7)可改善心肌梗死或高血压所致的左室重构,但对于糖尿病性心肌病的作用不明。Ang-(1-7)通过结合哪些受体起作用一直备受争议。随着G蛋自偶联受体Mas受体(Mas receptor,MasR)的发现,越来越多的研究表明,Ang-(1-7)的作用可能是由Mas受体介导。MasR在心脏、肾脏和血管等组织中高表达,但Ang-(1-7)对于其他RAS受体的作用不明。一项研究表明,血管紧张素Ⅱ2型受体(angiotensin Ⅱ type2receptor,AT2R)拮抗齐(?)PD123319和MasR拮抗剂A779均可阻断Ang-(1-7)(?)内血管保护作用,提示Ang-(1-7)通过同时与AT2R和MasR结合而起作用。我们近期的研究发现,ACE2过表达可降低AT1R表达,提示ACE2/Ang-(1-7)的作用机制涉及MasR以外的受体。虽然文献已证实Ang-(1-7)在左室重构和功能障碍中发挥保护作用,但在糖尿病性心肌病右室重构和功能不全中的作用尚无报道。尤为重要的是,糖尿病对左心室的作用不能直接外推至右心室研究。左、右心室的胚胎发育、结构和功能是完全不同的。与左心室相比,右心室较小,月牙状,室壁薄,后负荷低,这可能是由左、右心室胚胎起源不同所导致的。因此,右心室对于糖尿病的影响和药物治疗的反应可能与左心室不同。研究目的本研究旨在回答以下问题：(1)糖尿病性心肌病中左室纤维化、肥厚、心肌细胞凋亡和功能障碍是否与右室的改变相平行?(2)长期应用Ang-(1-7)干预是否剂量依赖性地改善糖尿病性心肌病大鼠的右室重构和功能?若能改善,其分子机制是什么?(3)联合应用Ang-(1-7)和ACE抑制剂干预是否优于二者单一药物干预?研究方法动物模型将雄性Wistar人鼠随机分为模型组和正常对照组。通过腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin, STZ)诱导模型组人鼠产生糖尿病。12周末将模型组大鼠随机分为8组：模型组、培哚普利组、低剂量Ang-(1-7)组、中剂量Ang-(1-7)组、高剂量Ang-(1-7)组、高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组、高剂量Ang-(1-7)+A779组和高剂量Ang-(1-7)+PD123319组。血医、心率及右室内压力测量应用tail-cuff法测量尾动脉收缩压、舒张压、平均动脉压和心率；应用Millar微导管测量右室内压力。血液生化指标检测大鼠空腹12hr后抽取颈静脉窦血,利用Bayer1650血生化分析仪检测血清总胆固醇、甘油三酯和血糖水平。组织学和免疫组织化学分析制备厚度为4μm的石蜡切片,进行Masson染色以评价心肌组织形态和间质及血管周围纤维化程度。利用胶原Ⅰ、Ⅲ的免疫组织化学染色测定心肌胶原ⅠⅢ的含量及其比值。心肌细胞肥大和凋亡的测定利用Alexa Fluor(?)488标记的麦胚凝集素(wheat germ agglutinin, WGA)染色测定心肌细胞的横截面积；利用TUNEL法测定心肌细胞的凋亡率。实时定量RT-PCR利用实时定量RT-PCR测定基基因mRNA水平,用2-△△CT法定量mRNA相对水平。β-actin基因用作内参基因。Western BlotWestern Blot分析按标准步骤进行。ACE和ACE2活性的测定应用荧光定量检测试剂盒测定ACE和ACE2的活性二氢乙锭染色和光泽精增强化学发光实验利用二氢乙锭染色测定心肌冰冻切片中超氧阴离子(O2-)的水平。利用光泽精增强化学发光法检测心肌组织中NADPH氧化酶的活性酶联免疫吸附试验(ELISA)ELISA测定右室成纤维细胞培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和转化生长因子β1(TGF-β1)的水平。右室成纤维细胞和心肌细胞共培养右室成纤维细胞与Ang-(1-7)处理或未处理右室心肌细胞或其条件培养基共培养,ELISA测定培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平统计学分析利用SPSS v11.5软件分析数据,连续型变量以平均数±标准误表示。当P<0.05时认为有统计学意义。研究结果血脂和空腹血糖水平STZ注射1周后,模型组大鼠空腹血糖显著升高,并持续至实验结束。与之相似,模型组大鼠血清总胆固醇和甘油三酯水平明显高于正常对照组。在16周末,血清总胆固醇、甘油三酯和空腹血糖水平在模型组和各干预组间无明显差异(P>0.05)。各干预组未观察到明显的不良反应。右室的收缩和舒张功能STZ注射16周后,与正常对照组相比,糖尿病模型组大鼠出现显著的右室舒张功能障碍,表现为右室舒张末期压力(right ventricular end-diastolic pressure, RVEDP)和右室舒张时间常数(Tau)升高；模型组大鼠右室收缩功能亦降低,表现为右室最大压力上升速率(maximal rate of pressure increase, dP/dtmax)显著降低。Ang-(1-7)干预4周可剂量依赖性地降低RVEDP和Tau,并升高dP/dtmax至正常水平;Ang-(1-7)的上述作用可被A779或PD123319联用抑制。培哚普利单独干预可显著降低Tau,并升高dP/dtmax至正常水平。与模型级相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠的RVEDP和Tau显著降低,而dP/dtmax显著升高。Ang-(1-7)(?)(?)大鼠血压和心率无明显影响。培哚普利单独干预或与高剂量Ang-(1-7)联合干预均显著降低糖尿病大鼠的收缩压舒张压和平均动脉村,对心率亦无明显影响。糖尿病对左、右心室的病理形态学及分子水平的影响与正常对照组相比,糖尿病模型组大鼠的左、右心室中胶原分数(collagen volume fraction, CVF)、血管周围胶原面积与管腔面积的比值(perivascular collagen area/luminal area, PVCA/LA)以及胶原Ⅰ、Ⅲ的含量及其比值均升高；左、右室中纤维连接蛋白1和TGF-β1的mRNA表达、TGF-β1的蛋白表达以及Smad3(?)的磷酸化水平均升高；左、右室中Smad7的蛋白表达均降低。与正常对照组相比,糖尿病模型组大鼠左室的心肌细胞横截面积和(?)β-MHC mRNA表达均显著升高,而右室无明显变化；另外在左、右室中,BNP mRNA表达均显著升高。与正常对照组相比,糖尿病模型组人鼠左室中TUNEL阳性细胞比例、Bax mRNA表达、Ba(?)与Bcl-2的mRNA和蛋白表达的比值均显著升高,而在右室中无明显变化；左室中Bcl-2的mRNA和蛋白表达均显著降低,而在右室中无明显变化；另外在左、右室中,Bax的蛋白表达均无明显改变。Ang-(1-7)抑制糖尿病右室纤维化Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低右室内CVF和PVCA,LA,其作用可被MasR拮抗剂A779(?)完全阻断,并被AT2R拮抗剂(?)PD123319部分阻断。另外,与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)和培哚为普利联合干预显著降低右室中CVF和PVCA/LA;高剂量Ang-(1-7(?)培哚普利组和高剂量Ang-(1-7)(?)(?)相比,右室中CVF和(?)PVCA/LA均无显著性差异；另外,高剂量Ang-(1-7)组大鼠右室中CVF和PVCA/LA显著低于培哚普利组。与模型组相比,Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低右室胶原Ⅰ、Ⅲ的含量,而对胶原Ⅰ、Ⅲ的比值无显著影响。Ang-(1-7)对胶原Ⅰ、Ⅲ表达的抑制作用可被A779或PD123319阻断。培哚普利单独干预显著降低胶原Ⅰ含量,而对胶原Ⅲ含量和胶原Ⅰ、Ⅲ的比值无显著降低作用。高剂量Ang-(1-7)组大鼠右室中胶原Ⅰ、Ⅲ的含量及其比值均显著低于培哚普利组。与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室内胶原Ⅰ、Ⅲ含量及其比值均显著降低。与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室内胶原Ⅰ、Ⅲ含量及其比值均无明显变化。与模型组相比,Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低右室中纤维连接蛋白1和TGF-β1的mRNA表达,Ang-(1-7)对纤维连接蛋白1mRNA表达的抑制作用可被A779完全阻断,对TGF-β1mRNA表达的抑制作用可被A779或PD123319完全阻断。与模型组相比,培哚普利组大鼠右室中纤维连接蛋白1和TGF-β1的mRNA表达显著降低;与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室中纤维连接蛋白1和TGF-β1的mRNA表达显著下降；高剂量Ang-(1-7)组和培哚普利组相比,右室中纤维连接蛋白1和TGF-β1的JmRNA表达均无显著性差异。与模型组相比,Ang-(1-7)可剂量依赖性地降低右室内TGF-β1的蛋白水平和Smad3的磷酸化水平,并剂量依赖性地升高Smad7的蛋白水平;Ang-(1-7)对TGF-β1蛋白表达和Smad3磷酸化的抑制作用可被A779或PD123319阻断,对Smad7蛋白的上调作用可被A779阻断而不被PD123319阻断。Ang-(1-7)改善糖尿病右室心肌的氧化应激糖尿病可加重大鼠左、右室的氧化应激,表现为02-水平和(?)NADPH氧化酶活性的升高。Ang-(1-7)可剂量依赖性地降低右室内升高的02-水平和NADPH氧化酶活性,联合应用A779或PD123319可部分阻断Ang-(1-7)对O2-水平和(?)INADPH氧化酶活性的降低作用。培哚普利单独干预或与高剂量Ang-(1-7)联合干预均可显著降低右室内O2-的水平和NADPH氧化酶的活性；中、高剂量Ang-(1-7)组右室内O2-含量显著低于培哚普利组,而NADPH氧化酶活性无显著性差异；与培哚普利组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室内O2-含量和NADPH氧化酶活性均显著降低。与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室内O2-含量和NADPH氧化酶活性均无明显改变。心肌内ACE和ACE2的表达与活性糖尿病大鼠左、右心室内ACE的表达和活性均升高；与之不同,ACE2的表达和活性在右室降低,而在左室无明显改变。与模型组相比,Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低右室内ACE的蛋白表达与活性,提高ACE2的蛋自表达,而对ACE2的活性无显著影响；联合应用A779可阻断Ang-(1-7)对ACE2表达的上调作用;联合应用A779或PD123319均不能阻断Ang-(1-7)对ACE表达和活性的下调作用。培哚普利干预可显著降低ACE的蛋白表达和活性,升高ACE2的蛋白表达和活性；与高剂量Ang-(1-7)组相比,培哚普利组人鼠右室内ACE活性更低,余参数无统计学差异。与高剂量Ang-(1-7)组相比,高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组大鼠右室内ACE的蛋白表达和活性更低,而ACE2的蛋白表达和活性无显著性差异。高剂量Ang-(1-7)+培哚普利组与培哚普利组相比,右室内ACE与ACE2的表达和活性均无显著性差异。AT1R、AT2R和MasR的表达糖尿病大鼠左、右心室内AT1R的表达均高于正常对照组大鼠,而4周的Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地降低右室内AT1R表达。Ang-(1-7)对AT1R表达的抑制作用可被A779或PD123319阻断。培哚普利单显著升高右室AT1R的表达,而高剂量Ang-(1-7)单用和与培哚普利联用相比,AT1R表达无显著性差异。糖尿病大鼠左、右心室内AT2R的表达均低于正常对照组大鼠,而4周的Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地升高右室内AT2R表达。Ang-(1-7)的这一作用可被A779部分阻断,并被PD123319完全阻断。培哚普利干预对AT2R(?)内表达无显著性影响。高剂量Ang-(1-7)单用和与培哚普利联用相比,AT2R表达亦无显著性差异。糖尿病不能明显影响左、右心室内MasR的表达。同时,Ang-(1-7)或培哚普利对糖尿病大鼠右室内MasR(?)内表达亦无显著影响。Ang-(1-7)降低右室成纤维细胞培养基中胶原和TGF-β的含量高糖刺激可显著增加右室成纤维细胞培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的含量。Ang-(1-7)处理72hr可明显降低培养基中,胶原Ⅰ、Ⅲ和(?)TGF-β1的含量；而联用A779可完全阴断(?)Ang-(1-7)的作用。右室成纤维细胞-右室心肌细跑交互作用促进胶原和TGF-β1的生成右室成纤维细胞+未处理右室心肌细胞组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平显著高于右室成纤维细胞组。而右室成纤维细胞+Ang-(1-7)处理心肌细胞组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平显著低于右室成纤维细胞+未处理右室心肌细胞组。右室成纤维细胞+未处理右室心肌细胞培养基组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1的蛋白水平明显高于右室成纤维细胞组。而右室成纤维细胞+Ang-(1-7)处理心肌细胞培养基组的培养基中胶原Ⅰ、Ⅲ和TGF-β1(?)的蛋白水平显著低于右室成纤维细胞+未处理右室心肌细胞培养基组。Ang-(1-7)对右室成纤维细胞-右室心肌细胞交互作用诱导的胶原和TGF-β1生成的降低作用可被A779或PD123319(?)(?)用抑制。研究结论(1)1型糖尿病可诱导大鼠产生明显的右心室纤维化及右室收缩和舒张功能障碍,而右室肥厚和心肌细胞凋亡不明显。(2)长期(?)Ang-(1-7)干预可剂量依赖性地改善糖尿病性心肌病右室重构,包括减轻右室纤维化以及收缩和舒张功勇障碍。(3)Ang-(1-7)发挥右室保护作用的细胞机制包括Ang-(1-7)抑制高糖刺激下的右室成纤维细胞分泌胶原和(?)TGF-β1以及抑制右室心肌成纤维细胞和右室心肌细胞间的交互作用(4)Ang-(1-7)发挥右室保护作用的分子机制包括Ang-(1-7)抑制氧化应激；上调Smad7表达并抑制(?)JTGF-β1/Smad3致纤维化信号转导通路；下调右室ACE的表达和活性而上调ACE2的表达；下调右室AT1R的表达而上调AT2R的表达；其保护作用由MasR和AT2R(?)同介导。研究背景进入本世纪以来,2型糖尿病的发病率在世界范围内不断提高。糖尿病已经成为我国的一个重要的公共健康问题。许多流行病学、临床和尸体解剖研究证实,即使没有高血压和冠状动脉疾病,糖尿病患者也会伴有心功能不今。因此,糖尿病性心肌病是糖尿病患者的一个独立并发症。现已证实糖尿病性心肌病可表现为心肌舒张和收缩功能障础以及结构异常。即使在无症状的糖尿病患者,舒张功能障碍也很常见。心肌中的血管紧张素(1-7)[angiotensin-(1-7),Ang-(1-7)]由包括血管紧张素转化酶2(angiotensin-converting enzyme2,ACE2)在内的几种肽链内切酶和羧基肽酶催化分解血管紧张素Ⅰ(angiotensin Ⅰ,Ang-Ⅰ)和血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,Ang-Ⅱ)而产生。最近,我们和其他研究者均报道,ACE2和Ang-(1-7)在体内和体外均发挥心脏保护作用。此外,我们还发现,血浆Ang-(1-7)水平与急性心肌梗死患者再灌注治疗后心肌损伤的改善和左室功能的恢复密切相关。然而,血浆Ang-(1-7)(?)的水平和糖尿病患者的心肌重构和功能之间的关系尚不明确。研究目的评估2型糖尿病患者血浆Ang-(1-7)水平和左室功能的相关性。研究方法受试对象连续收录2012年2月到9月间就珍于山东大学齐鲁医院的2型糖尿病病史超过5年的患者共110例。糖尿病定义为空腹血糖(fasting blood glucose, FBG)≥7mmol/L或正在服用降血糖药物。以下患者不纳入本项研究：(1)患有以下疾病者：冠状动脉疾病(心绞痛病史、胸痛、心电图改变、平板运动试验阳性)；高血压;心脏瓣膜病；终末期肝肾疾病;恶性肿瘤;(2)经胸超声检查透志窗条件较差的患者。体格检查和血液分析由临床专业研究人员测量患者身高、体重和血压。坐位休息15分钟后测量7次血压,取最后3次的平均值。空腹12小时后,采集静脉血液样本送山东大学齐鲁医院内分泌实验室和检验科检测糖化血红蛋白(glycated hemoglobin A1c, HbA1c)、FBG、血清甘油三酯(triglyceride, TG)、总胆因醇(total serum cholesterol,TC)、高密度脂蛋白胆固醇(high-density lipoprotein cholesterol, HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low-density lipoprotein cholesterol, LDL-C)和N-末端前脑钠肽(N-terminal pro-B-type natriuretic peptide, NT-proBNP)的水平。将蛋白酶抑制剂加入静脉血中,利用ELISA测定血浆Ang-(1-7)和Ang-Ⅱ水平。超声心动图利用Philips iE33心脏超声仪分别测量左室射血分数(ejection fraction, EF)、舒张早期二尖瓣血流速度与舒张晚期二尖瓣血流速度比值(E/A)和舒张早期尖瓣血流速度与舒张早期二尖瓣环运动速度的比值(E/Ea)。统计学分析连续型变量用平均值±标准误或中位数[四分位数间距]表示。使用SPSSv19软件进行数据分析。比较两组间连续型变量时,根据正态性检验方差齐性检验的结果选择非配对t检验、Welch’s检验或Mann-Whitney U(?)检验。根据正态性检验的结果选择Pearson相关分析或Spearman(?)(?)相关分析,以探索并筛选决定左室功能的潜在因素。最后进行逐步多元回归分析,以确定预测心脏功能指标的相关因子。双侧P<0.05时认为差异有统计学意义。研究结果EF<50%的患者血浆Ang-(1-7)水平显著低于EF≥50%的患者;E/A<1的患者血浆Ang-(1-7)水平显著低于E/A≥1的患者；E/Ea>15的患者血浆Ang-(1-7)水平显著低于E/Ea≤15的患者。单因素相关性分析结果表明,血浆Ang-(1-7)水平与E/Ea和NT-proBNP呈负相关,与EF和E/A呈正相关。多元逐步回归分析结果显示：Ang-(1-7)、HbA1c和Ang-Ⅱ水平以及糖尿病病程是EF的独立相关因子；Ang-(1-7)、FBG、LDL-C水平和糖尿病病程是E/A的独立相关因子；Ang-(1-7)和(?)HbA1c水平是E/Ea的独立相关因子。研究结论(1)即便没有冠心病、高血压病及心脏瓣膜病,2型糖尿病患者亦有很高的左室功能不全发生率,且与糖尿病病程、HbA1c和FBG水平等因素密切相关。(2)血浆Ang-(1-7)水平是2型糖尿病患者左室功能的独立相关因子,有望成为评估心功能的生物标志物。