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体细胞核重编程不完全是造成体细胞核移植效率低的主要原因之一，而表观遗传修饰异常与重编程不完全密切相关。表观遗传修饰包括DNA甲基化和组蛋白修饰等，DNMT1维持DNA甲基化，表达异常会引起DNA甲基化水平的异常。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小RNA，作用是降解靶基因或抑制靶基因的翻译。研究发现，高甲基化抑制miR-148a表达，DNMT1为miR-148a的靶基因，受miR-148a的调控。为进一步了解miR-148a与DNMT1在正常体细胞中是否存在相互作用关系，以及内源性miR-148a作为表观遗传修饰的调控因子在体细胞重编程过程中的作用与机制，本研究通过生物信息学和双荧光素酶检测方法在猪中验证了DNMT1是miR-148a的靶基因，及其相互作用关系，研究了过表达miR-148a对猪核移植胚胎发育的影响及其初步机理。研究取得如下主要结果: 1.miR-148生物信息学分析及miR-148a靶向调节DNMT1的功能验证 本研究利用软件预测了miR-148a的靶基因，双荧光素酶实验进行了靶基因验证。成熟序列比对发现，miR-148基因家族在第1至8位、11至19位高度保守，说明miR-148基因家族的高度保守性。进化树分析结果显示，miR-148基因家族主要分为哺乳动物miR-152、鱼类miR-152和miR-148a/b两支。靶基因GO和KEGG分析发现，miR-148a靶基因富集于基因表达、转录调控活性、胚胎发育、癌症信号通路等过程中。双荧光素酶实验结果显示，猪DNMT1为miR-148a的靶基因。 2.miR-148a与DNMT1相互调控的研究 本研究克隆分析了猪的miR-148a启动子序列，结果显示，2043bp启动子序列中存在高甲基化位点，含两个启动子区，转录因子以Sp1、AP2为主。将克隆片段与pGL-3-Basic载体连接，结果显示，与未转染组相比，转染pGL3-148a-0.6K、pGL3-148a-1K质粒组荧光素酶比值无显著变化(P＞0.05)，转染pGL3-148a-2K和pGL3-promoter质粒组荧光素酶比值显著增加(P＜0.05)，说明2043bp序列具有启动子活性。5ng/mL和10ng/mL bFGF处理共转染pGL3-148a-2K和pRL-TK的猪成纤维细胞，结果显示，bFGF处理组细胞的双荧光素酶表达水平显著下降(P＜0.05)。5ng/mL和10ng/mLbFGF处理猪成纤维细胞，miR-148a的表达量逐渐下降，DNMT1表达逐渐增加，差异显著性(P＜0.05)。0.5μM和1μM5-aza-dC处理猪成纤维细胞，miR-148a的表达量逐渐升高，DNMT1表达逐渐降低，差异显著(P＜0.05)。 3.过表达miR-148a猪成纤维细胞系的建立及分析 本研究采用三质粒包装体系进行了高滴度慢病毒包装和感染，结果显示，miR-148a表达量提高了5倍，靶基因DNMT1表达显著降低（P＜0.05），DNMT3a基因表达变化不显著(P＞0.05);Western blot分析发现，过表达miR-148a组DNMT1蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。细胞免疫荧光结果显示，过表达miR-148a组DNA甲基化水平显著降低(P＜0.05)。过表达miR-148a后增殖受到抑制(P＜0.05)，G0/G1期细胞显著增加(p＜0.05）。 4.过表达miR-148a对猪核移植胚胎发育及相关基因表达的影响 本研究分析了miR-148a在体外成熟猪卵母细胞、孤雌胚胎(PA)及SCNT中的表达，及过表达miR-148a对猪SCNT胚胎发育、DNA甲基化、组蛋白修饰、合子启动基因和多能性因子表达的影响。结果显示，miR-148a在体外成熟猪卵母细胞中低表达，在早期PA中先升高后降低。除囊胚期外，miR-148a在猪SCNT胚胎中的表达显著低于PA和IVF胚胎(P＜0.05)。过表达miR-148a显著提高猪SCNT囊胚率(20.79％vs14.36％、14.9％,P＜0.05)和囊胚细胞总数(39.15±6.36vs33.25±7.14、34.38±8.50,P＜0.05)。过表达miR-148a,2-细胞和4-细胞期SCNT胚胎基因组DNA甲基化水平显著降低，2-细胞、4-细胞和囊胚期DNMT1表达亦显著降低(P＜0.05)，2-细胞和4-细胞期DNMT3a、TET1、TET3表达显著升高，2-细胞和囊胚期TET2表达亦显著升高(P＜0.05)。此外，过表达miR-148a，2-细胞和4-细胞期H3K4me3表达显著提高(P＜0.05)，4-细胞和囊胚期H3K9me3表达显著降低(P＜0.05)，2-细胞期H3K9ac表达显著提高(P＜0.05)，2-细胞期HDAC1、HDAC2、KDM5A、HAT1表达显著提高(P＜0.05)，4-细胞期HDAC2表达显著降低(P＜0.05)，2-细胞和4-细胞期eIF3A和TFIIA、囊胚期Oct4、Nanog表达显著提高(P＜0.05)。 以上结果表明，DNMT1是miR-148a的靶基因，两者之间存在相互调控的作用。过表达miR-148a可下调DNMT1基因的表达，上调重编程相关基因表达，提高猪核移植胚胎早期发育能力。