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目的: 研究逆转素reversine对肝星状细胞(hepaticstellatecells,HSC)的细胞周期、凋亡及其转化生长因子-beta(TGF-β)通路激活的影响,并探讨相关作用机制。 方法: 1.不同浓度的reversine干预处理HSC24h,CCK-8法检测reversine对HSC增殖的影响,通过拟优合曲线计算半数抑制浓度,即IC50值。 2.根据IC50值选择5个浓度(即:0μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml)的reversine进行后续试验。显微镜下观察各浓度的reversine干预HSC24h后的细胞生长形态。 3.Flowcytometry检测reversine对HSC的细胞周期和细胞凋亡的影响。 4.免疫荧光法和westernblot法检测HSC中细胞周期调控蛋白p16和极光酶B(AuroraB)蛋白的表达,检测天冬氨酸蛋白水解酶3(caspase-3)和B细胞淋巴瘤/白血病-2(bcl-2)两个凋亡相关蛋白的表达。 5.免疫荧光法和westernblot法检测HSC中的I型胶原蛋白(collagen-I)、转化生长因子β1(TGF-β1)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及基质金属蛋白酶剂1(TIMP1)的蛋白表达。 6.应用外源性生长因子Tβ1激活HSC,westernblot法检测激活的HSC中的平滑肌肌动蛋白α(α-SMA)、collagen-I及TGF-β1的表达。 结果: 1.reversine抑制HSC的增殖,抑制率随着加药浓度的增加而增加,呈剂量依赖关系。通过拟优合曲线计算IC50值为13.58μg/ml。 2.reversine改变HSC形态,可使细胞扁平、变圆、皱缩、脱落,连接消失,核质浓缩或呈分叶状,甚至凋亡。 3.流式细胞学检测5μg/ml组,10μg/ml组,20μg/ml组及40μg/ml组G2/M期细胞比例分别为(10.19±3.34)%,(25.87±2.11)%,(28.90±11.0)%及(31.38±1.68)%,随着reversine浓度增加,HSC停滞于G2//M期的细胞比例增加。流式细胞学检测5μg/ml组,10μg/ml组,20μg/ml组及40μg/ml组总凋亡率分别为(10.75±1.78)%,(15.38±2.07)%,(20.87±1.51)%及(22.26±1.75)%,早期凋亡率分别为(4.33±0.59)%,(6.38±0.55)%,(8.25±0.20)%及(8.86±0.49)%;晚期凋亡率分别为(6.42±1.20)%,(9.00±1.52)%,(12.63±1.41)%及(13.40±1.25)%。随着reversine浓度增加,HSC早期凋亡率、晚期凋亡率以及总凋亡率逐渐增加,呈剂量依赖关系。 4.reversine下调HSC中AuroraB及bcl-2蛋白的表达,上调p16表达及促进caspase-3蛋白的活化。 5.reversine抑制HSC中collagen-I、TGF-β1、TIMP1蛋白的表达,促进MMP9蛋白表达。 6.应用TGF-β激活HSC后,可以发现α-SMA、collagen-I、TGF-β1蛋白表达增加;reversine可下调激活的HSC中α-SMA、collagen-I、TGF-β1蛋白表达。 结论: 1.reversine可诱导HSC停滞于G2/M期,抑制细胞增殖,同时促进p16蛋白表达、抑制AuroraB蛋白表达。 2.reversine可通过促进caspase-3蛋白活化、抑制bcl-2蛋白表达的方式诱导HSC凋亡。 3.reversine能下调HSC细胞外基质中collagen-I的表达,其机制可能与调节MMP9/TIMP1、TGF-β1表达有关。 4.reversine能抑制HSC的TGF-β通路的激活,并下调激活细胞中collagen-I及TGF-β1的表达。