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临床上及早发现基因突变对肿瘤的个体化治疗有着非常重要的意义。目前,常规PCR+Sanger测序检测突变应用最为广泛,但该法只能检测含量在15%-20%以上的突变基因,并且操作繁琐、价格昂贵,其它方法也各有不足,现缺少一种简便、快速、价廉、灵敏、仪器常见、可同时对多个突变位点进行初歩筛查的方法。为解决上述问题,本文采用基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR(coamplification at lower denaturation temperature-PCR)用于快速KRAS突变的筛查。其中,COLD-PCR利用DNA双链的熔解温度与其序列相关的性质,通过改变变性温度,能在大量野生型基因中选择性地富集突变基因;Taqman探针联合DNA结合染料法是指在实时荧光定量PCR(real-time fluorescent quantitative PCR,q PCR)反应体系中同时加入DNA结合染料和针对野生型序列的Taqman探针用于终点荧光信号的检测。该技术可选择性富集和筛选与野生型探针不匹配的各种突变,即可同时筛选多种突变,而不论突变是已知或未知、单个或多个、点突变还是长串突变。KRAS基因突变被发现广泛存在于包括肺癌在内的多种癌症,检测KRAS突变的临床意义重大,本文通过对肺癌中KRAS基因突变的检测探讨该方法的可行性。目的:建立基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法检测KRAS基因突变,验证其可行性,并应用于临床样本中KRAS突变的快速筛查。方法:1.选取KRAS纯合野生型和纯合突变型细胞株;设计特异的引物、针对KRAS野生型序列的探针及突变型序列的探针(均用ROX标记);提取细胞株DNA,用常规PCR扩增,产物测序验证基因型。2.用染料(EVAgreen)q PCR法分别扩增KRAS突变型和野生型DNA,逐渐降低变性温度,以突变DNA有扩增而野生DNA基本无扩增时的变性温度为COLD-PCR的最佳严格解链温度(critical denaturation temperature,Tc),建立COLD-PCR循环条件。3.在染料q PCR体系中加入野生型探针,优化体系及常规PCR循环条件,建立Taqman探针联合DNA结合染料的常规q PCR法(方法一)。4.在方法一的基础上,将常规PCR循环条件改为COLD-PCR,建立基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法(方法二)。5.用两种方法分别扩增不同KRAS突变比例的标准品,记录EVAgreen染料与ROX标记探针的终点荧光强度并计算EVA/ROX比值,分别统计分析三组EVA/ROX的平均值及标准偏差,计为means±SD。以能准确检测到区别于纯野生型KRAS基因EVA/ROX值的最小EVA/ROX值所对应的标准品比例为最低检测限。6.将两种方法中的野生型探针换成突变型探针,分别扩增不同KRAS突变比例的标准品,观察染料及突变探针的荧光强度及趋势,验证方法一、二可行性。7.收集25例肺癌患者血样、提取DNA,用两种方法分别检测KRAS突变。检测有KRAS突变的血液样本,取其余下DNA用常规PCR试剂盒,以常规PCR或COLD-PCR循环条件扩增,再Sanger测序,精确验证是否有KRAS突变。结果:1.测序结果验证了两细胞株均含预期基因型。COLD-PCR时的Tc值为80.5℃。2.两方法检测不同比例KRAS突变标准品,得到了终点信号EVA/ROX的means±SD,方法一和方法二最低检测限分别为10%、5%。比较两方法的最低检测限可得:与常规PCR循环条件相比,COLD-PCR条件下能更好的富集突变。3.两方法中野生型探针替换成突变型探针后,观察到染料和突变探针的荧光强度及趋势均符合预期,验证了两方法的可行性。4.25例血液样本中,方法一未检出KRAS突变,方法二检出一例有KRAS突变,分析该样本EVA/ROX的比值,对比方法二标准品的比值,可以半定量的判断该样本KRAS突变比例在5%-10%之间。5.方法二检出有KRAS突变的血样,常规PCR条件扩增的产物测序未见KRAS突变,COLD-PCR条件扩增的产物测序有KRAS突变。不但证实了方法二的准确性,还说明与常规PCR相比,COLD-PCR能更好的富集突变,提高了下游测序检测突变的敏感性。结论:1.本研究成功建立了基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法,最低检测限为5%,比常规PCR+Sanger测序法的15%-20%高。该方法能用血液样本,具有无创性以及简便、快速、价廉、灵敏、仪器常见等特点,原理上能同时筛选多种突变,可用于KRAS突变的快速筛查。2.与常规PCR相比,COLD-PCR能更好的富集突变,提高了下游测序技术检测突变的敏感性。基于Taqman探针联合DNA结合染料的COLD-PCR法初筛后有突变的样本可将余下DNA行COLD-PCR,产物测序,达到精确检测突变的目的。