【摘 要】
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目的:探究褪黑素能否通过调节胃癌细胞外泌体的产生,而影响肿瘤微环境中巨噬细胞的功能,调节机体的抗肿瘤免疫,最终产生抗肿瘤的效果。为丰富褪黑素调节机体免疫和抗胃癌机制的认识提供新的理论依据。方法:1.超速离心获取无外泌体血清,培养胃癌细胞株,利用差速-超速离心的方法从胃癌细胞培养液中获取胃癌细胞外泌体,检测外泌体纯度。将胃癌细胞外泌体做PKH67荧光染色后与巨噬细胞株共培养,荧光显微镜下观察巨噬细胞
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目的:探究褪黑素能否通过调节胃癌细胞外泌体的产生,而影响肿瘤微环境中巨噬细胞的功能,调节机体的抗肿瘤免疫,最终产生抗肿瘤的效果。为丰富褪黑素调节机体免疫和抗胃癌机制的认识提供新的理论依据。方法:1.超速离心获取无外泌体血清,培养胃癌细胞株,利用差速-超速离心的方法从胃癌细胞培养液中获取胃癌细胞外泌体,检测外泌体纯度。将胃癌细胞外泌体做PKH67荧光染色后与巨噬细胞株共培养,荧光显微镜下观察巨噬细胞吞噬外泌体情况。2.将胃癌细胞外泌体与巨噬细胞株共培养,运用ELISA方法检测培养液中TNF-α、IL-6、IL-10、CXCL10、MCP-1的水平,Western blot和RT-q PCR的方法检测巨噬细胞PDL1的水平。3.褪黑素干预胃癌细胞株,提取外泌体,并检测胃癌细胞和外泌体中PDL1的水平。4.褪黑素干预胃癌细胞株,提取外泌体,与巨噬细胞株共培养,运用ELISA方法检测共培养体系培养液中TNF-α、IL-6、IL-10、CXCL10、MCP-1的水平。Western blot和RT-q PCR的方法检测共培养巨噬细胞PDL1的水平。5.利用数据库筛选针对PDL1的microRNA,体外合成microRNA并转染巨噬细胞株,运用Western blot和RT-q PCR方法检测各组巨噬细胞PDL1的水平,RT-q PCR的方法检测褪黑素干预的胃癌细胞及其外泌体中microRNA的水平。6.胃癌细胞外泌体注射到C57BL/6小鼠右腋皮下,并在右腋皮下荷胃癌细胞,监测成瘤周期及瘤块生长状况。结果:1.成功获取纯度较高的胃癌细胞外泌体,RAW 264.7巨噬细胞能够吞噬胃癌细胞产生的外泌体。胃癌细胞外泌体能抑制RAW 264.7巨噬细胞分泌TNF-α、CXCL10、IL-10的分泌,促进巨噬细胞PDL1的表达。2.与对照组相比,褪黑素处理后胃癌细胞产生的外泌体能促进TNF-α和CXCL10的分泌,抑制MCP-1、IL-6和PDL1的表达。3.数据库预测并经过体外合成microRNA干预细胞实验,验证了microRNA-20b-5p、microRNA-17-5p和microRNA-93-5p能抑制RAW 264.7巨噬细胞株PDL1的表达。4.褪黑素能抑制胃癌细胞PDL1的表达,调节胃癌细胞外泌体PDL1蛋白的水平,促进胃癌细胞内microRNA-20a-5p、microRNA-20b-5p、microRNA-106b-5p、microRNA-93-5p的表达,促进胃癌细胞外泌体内microRNA-20a-5p、microRNA-106b-5p表达,并有一定的剂量依赖性。5.胃癌细胞外泌体能促进肿瘤的发展,褪黑素处理胃癌细胞后产生的外泌体引起机体免疫抑制的效果降低。结论:1.胃癌细胞分泌的外泌体能抑制巨噬细胞TNF-α、IL-10、CXCL10的分泌,促进PDL1的表达,抑制巨噬细胞的免疫功能;2.褪黑素处理后胃癌细胞产生的外泌体能促进TNF-α和CXCL10的分泌,抑制MCP-1、IL-6和PDL1的表达,逆转了胃癌细胞外泌体导致的巨噬细胞的免疫抑制;3.microRNA-20b-5p、microRNA-17-5p、microRNA-93-5p能够抑制RAW264.7巨噬细胞内PDL1的表达;4.褪黑素能促进胃癌细胞内microRNA-20a-5p、microRNA-20b-5p、microRNA-106a-5p、microRNA-106b-5p、microRNA-17-5p和microRNA-93-5p的表达,并通过提升胃癌细胞外泌体中microRNA-20b-5p、microRNA-17-5p和microRNA-93-5p表达水平抑制巨噬细胞PDL1的表达。
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