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研究目的构建稳定表达人AR的Hep G2细胞系,分别转染空质粒、HBx野生型质粒和变异型质粒至Hep G2细胞,通过检测细胞的迁移力、增殖周期和细胞凋亡等,探究HCC相关HBx变异与AR的交互作用对肝癌恶性程度的影响。研究方法1.构建携带人AR外显子基因、绿色荧光蛋白基因(GFP)及嘌呤霉素基因(PM)的重组表达质粒(p CDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro);2.重组表达质粒包装感染Hep G2细胞及嘌呤霉素加压筛选,构建能稳定表达人AR的Hep G2细胞系;3.分别以慢病毒空载体、携带HBx野生型全长基因的慢病毒载体以及携带A1727G+A1762T/G1764组合突变或3’端缺失突变的HBx基因的慢病毒载体,瞬时转染Hep G2-GFP-AR细胞,通过细胞迁移实验和流式细胞技术检测细胞周期和细胞凋亡,观察不同HBx与AR在乙肝相关性肝癌发生发展中的作用。结果1.成功构建了携带人AR基因的慢病毒表达载体p CDH-CMV-MCSEF1-GFP-Puro-AR。2.通过携带AR基因的慢病毒感染Hep G2细胞,筛选出稳定高表达人AR的Hep G2细胞株,经流式细胞术验证其GFP的表达量,传至第10代后,该细胞株GFP的表达量为97.7%;Western-blot实验鉴定单克隆细胞株传至第14代时AR的表达量,2号克隆AR的表达量较高。3.选取AR表达量较高的2号克隆用于后续功能实验,Transwell实验结果显示:HBx空转染组在加入DHT后,下室中细胞OD值(0.45±0.02)显著高于未加DHT组(0.33±0.03),p<0.001;与未转染HBx基因的Hep G2-GFP-AR细胞(空-组)(0.33±0.03)比较,转染携带HBx A1727G+A1762T/G1764组合突变(167-组)(0.43±0.01,p=0.001)或3’端缺失突变(CT-组)(0.45±0.03,p<0.001)的质粒后,下室中细胞OD值显著增高;Hep G2-GFP-AR细胞在分别转染HBx A1727G+A1762T/G1764组合突变(167-组)或3’端缺失突变(CT-组)的质粒后,加入DHT时,下室中细胞OD值显著降低(167-组vs 167+组,0.43±0.01 vs 0.36±0.02,p=0.009;CT-组vs CT+组,0.45±0.03 vs 0.35±0.04,p=0.001)。细胞周期实验结果显示:各组间G2+S期细胞总占比无显著统计学差异。细胞凋亡实验结果显示:各组间细胞总凋亡率无显著统计学差异。结论1.本实验成功构建了携带人AR外显子基因的慢病毒表达载体p CDH-CMVMCS-EF1-GFP-Puro-AR;并利用该载体,慢病毒感染Hep G2细胞,成功构建了稳定表达AR的Hep G2细胞系Hep G2-GFP-AR。2.通过AR高表达细胞系Hep G2-GFP-AR进一步功能实验,发现在高表达AR的Hep G2-GFP-AR细胞中,转染空载体组加入DHT后细胞迁移能力显著增强,而转染HBx组合突变或3’端缺失突变的HBx后亦能够增强细胞的迁移能力;但加入DHT后则对HBx A1727G+A1762T/G1764组合突变或3’端缺失突变提高肿瘤细胞迁移能力的效应可能具有抑制作用;本研究未发现HBx相关突变株以及AR对Hep G2细胞的增殖和凋亡有显著影响。