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研究目的和背景随着现代社会经济水平的显著上升及人们生活方式的改变,糖尿病尤其是2型糖尿病（T2DM）的发病在全球范围内已呈流行态势,糖尿病成为致死致残的主要原因之一,因此探索糖尿病的确切发病机制及新的治疗策略具有重要意义。肝脏作为体内重要的参与营养代谢的器官,通过一对拮抗激素胰岛素和胰高血糖素将血糖维持在稳定范围。饱腹时血中胰岛素水平升高,抑制肝脏糖异生;空腹时升高的胰高血糖素促进肝糖异生从而稳定血糖水平。2型糖尿病高血糖的发病机制之一是肝脏糖异生异常增强,因此揭示肝糖异生发生的分子机制将可能为治疗糖尿病提供新的思路。长链非编码RNA（Long non-coding RNAs,lnc RNAs）是一类长度大于200个核苷酸的非蛋白编码RNA。一些代谢组织里可发现存在异常表达的lnc RNAs,提示lnc RNAs可能参与糖代谢过程。但是,lnc RNAs在肝糖异生中的潜在作用仍未清楚。二甲双胍是目前临床上应用最为广泛的抗糖尿病药物,有研究表明它主要通过抑制肝糖异生减少葡萄糖输出,但确切机制仍然存在争议。为了探索lnc RNAs在二甲双胍抑制肝糖异生中的作用,我们对在c AMP诱导肝糖异生增强模型及在此基础上添加二甲双胍处理的小鼠肝原代细胞进行系统性lnc RNAs芯片分析,并挑选出若干差异表达的lnc RNA进行验证,以研究lnc RNAs是否介导糖异生过程及二甲双胍的降糖作用。材料与方法1.采用改良后的胶原酶两步灌流法分离小鼠肝脏原代细胞。2.肝原代细胞贴壁后,低糖加地塞米松预处理1216小时后,给予不同药物处理8小时,即对照组（糖异生底物乳酸钠和丙酮酸钠）、c AMP组（糖异生底物加c AMP）、二甲双胍组（糖异生底物加c AMP和二甲双胍）。3.收集对照组、c AMP组及二甲双胍组肝脏原代细胞RNA,利用RT-q PCR检测糖异生关键酶基因PEPCK m RNA的表达水平。4.三次三组肝细胞平行样本以Arraystar小鼠lnc RNA microarray 2.0版本进行lnc RNA的表达谱分析。RNA提取后经逆转录生成c DNA,经标记后与8′60 k芯片杂交。使用Agilent扫描仪扫描芯片的荧光强度,并将实验结果转换成数字型数据,最后使用相关软件进行分析运算。基因表达具有差异性的阈值设置为倍数改变绝对值经对数转换大于等于2,P值小于等于0.05。5.挑选感兴趣的lncRNAs进行RT-qPCR验证。6.生物信息学分析。结果1.与对照组相比,cAMP显著升高磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK）的mRNA表达水平（P<0.01）,二甲双胍组显著降低升高的PEPCK m RNA水平（P<0.01）。2.芯片结果显示在三组肝原代细胞上共检测了22,016个lnc RNAs,这些lnc RNAs搜集自最权威的数据库（如Ref Seq,UCSC,En Sembl,NRED等）和其它高水平文章。3.对差异表达的lnc RNA附近的蛋白编码基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）分析,包括生物学过程、细胞组成和分子功能。此外,我们也对差异表达的lnc RNAs附近的蛋白编码基因进行基因本体（Gene Ontology,GO）分析和信号通路（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genome,KEGG）分析。GO分析和KEGG分析为我们初步了解这些差异表达lnc RNAs的大体功能和可能参与的信号通路提供了基础。4.与对照组相比,cAMP上调了456个lncRNAs,其中189个lncRNAs被二甲双胍下调;与对照组相比,c AMP下调了409个lnc RNAs,其中167个lnc RNAs被二甲双胍上调。这356个被二甲双胍逆转的lnc RNAs具有一些基本的表达特征,按种类可分为:39个正义lnc RNAs、78个反义lnc RNAs、25个双向lnc RNAs和214个基因间lnc RNAs。这些lnc RNAs长度主要在4003600个核苷酸之间,转录自不同染色体。5.对于二甲双胍抑制c AMP上调lnc RNAs,我们挑出8条（AK133602,ENSMUST00000138573,ENSMUST00000129953,uc009njr.1,AA591058,NR027710,NR030715,ENSMUST00000145208）进行RT-q PCR验证,验证结果与芯片一致。6.对这8条lnc RNAs进行生物信息学分析,我们得到它们的核苷酸序列;其中NR027710和ENSMUST00000138573的相关蛋白编码基因分别为过氧化物酶增殖物激活受体γ共激活因子1α（PGC-1α）和G蛋白偶联受体155（Gpr155）。7.经RT-q PCR验证,PGC-1α和Gpr155的表达趋势与它们相关联的NR027710和ENSMUST00000138573相同,即c AMP上调PGC-1α和Gpr155的表达水平,二甲双胍抑制它们的表达（P<0.05）。结论1.二甲双胍可通过抑制糖异生关键酶基因的表达抑制肝脏糖异生。2.lncRNA芯片结果可靠,lncRNAs可能通过其临近蛋白编码基因参与多种生物学过程及代谢通路。3.经生物信息学分析,NR027710和ENSMUST00000138573分别与PGC-1α和Gpr155基因相关,可能涉及二甲双胍抑制肝糖异生过程。4.lnc RNAs可能广泛参与肝糖异生这一生理过程,并且二甲双胍可能通过调节一系列lnc RNAs的表达介导抑制肝糖异生这一过程。