目的:(1)研究兔角膜上皮、基质及内皮细胞体外培养的生物学特性,探索和改进这3种细胞体外培养的方法,为组织工程角膜奠定基础。(2)观察兔角膜3种细胞接种培养在羊膜的生长特性,为以羊膜为载体进行分层组织工程角膜研究打下基础。(3)初步探讨模拟微重力对兔角膜3种细胞体外培养的影响。 方法:(1)采用组织块法,消化法分离培养兔角膜上皮、基质和内皮细胞,观察细胞贴壁生长情况,同时对生长良好的原代细胞进行消化传代,进一步观察传代细胞的形态和生长情况。(2)将兔角膜上皮、基质和内皮细胞种植于羊膜进行体外培养,通过倒置显微镜、光镜及扫描电镜,观察培养细胞的生长、排列和细胞的粘附情况。(3)利用回转式生物反应器模拟微重力环境,在脱水牛基质载体上培养兔角膜3种细胞,使用CCK-8试剂检测细胞生长情况,倒置显微镜、扫描电镜等观察细胞的生物学特性。 结果:(1)兔角膜上皮、基质和内皮细胞均在培养24h—48h内贴壁生长,在培养6d—9d能形成良好单层,细胞形态典型,进行多次传代后细胞仍维持原有形态和功能,获得的细胞能进行长期培养。(2)兔角膜3种细胞在羊膜生长良好,可保持生理状态的细胞形态,细胞与羊膜组织粘附牢固。角膜上皮细胞可形成单层和复层,细胞间连接紧密。角膜基质细胞拉长生长,呈三角形和树枝状,细胞间连接明显,可形成网状连接。角膜内皮细胞可形成卵圆形或多角形,细胞大小一致,排列紧密。(3)兔角膜3种细胞均能在微重力条件下获得增殖。角膜上皮细胞呈球形,聚集成细胞团,细胞间连接紧密。CCK-8检测发现,角膜基质细胞和内皮细胞分别在培养第10d和第16d后,模拟微重力条件下细胞增殖较正常重力条件好。在模拟微重力环境下,角膜3种细胞的形态均较正常重力条件下更接近球状。 结论:(1)本研究为兔角膜上皮、基质和内皮细胞体外培养,提供了方便高效的方法,并对比了各种不同方法分离培养兔角膜3种细胞的生物学特性。(2)羊膜具有良好的支