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研究目的：高血压病在中国成人的发生率高达18%,目前我国约有2亿高血压病患者。脑卒中是高血压最重要的并发症之一,一旦发生病人非死即残。预防和治疗脑卒中已经成为科学研究迫切需要解决的问题。目前对脑卒中的预防和治疗,有药物降压、控血脂和抗凝等措施。但近年来脑卒中发生率仍呈持续上升趋势,全球每年仍新发脑卒中1500万,日益年轻化。脑卒中发生的病理生理机制非常复杂,有必要进行进一步的深入研究,找出更多的预防和治疗药物。雷帕霉素(Rapamycin, RAP)是20世纪70年代初由加拿大Ayerst研究所从放线菌培养液中分离出来的大环内酯类抗生素,现在作为免疫抑制剂已在临床上广泛使用。·作为国内外研究的热点,目前研究发现RAP具有抗衰老和神经营养等多种生物活性。既然有神经保护活性,那么RAP对缺血性脑损伤有没有保护作用?如果RAP有保护缺血性脑损伤的作用,那么确切机制是什么?因此,本课题主要针对这两个问题进行研究,以期发现RAP对缺血性脑损伤的保护作用,并对其机制进行初步探索。实验设计和方法：实验一、RAP对易卒中自发性高血压大鼠(SHR-SP)急性缺血性脑损伤影响：将50只3月龄雄性SHR-SPs随机分为5组,分别给予溶媒二甲亚砜(DMSO)和RAP0.3、1.0、3.0、10μg/kg腹腔注射(i.p.)给药3周后,进行电凝法大脑中动脉阻塞(MCAO)手术,术后24小时取脑染色分析。实验二、RAP对C57小鼠急性缺血性脑损伤影响：将70只3月龄雄性C57小鼠随机分为7组,分别给予溶媒DMSO和RAP 0.2、20、200μg/kg、2 mg/kg、20 mg/kg,连续i.p.给药3周后,称量体重,并进行MCAO手术,术后24小时取脑染色分析。实验三、微量RAP长期给药对SHR-SP寿命的影响：将30只3月龄雄性SHR-SPs随机分为2组,分别饲喂微量RAP药物饲料(3μg/kg/d)和普通饲料,记录生存时间。实验四、RAP对神经元细胞凋亡以及脑皮层线粒体功能的影响。1、RAP对原代神经元细胞凋亡的影响：培养SHR-SP胎鼠(20-23天龄)的原代神经元细胞,RAP给药3小时后双氧水(H2O2)或1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导原代神经元细胞凋亡造模,Hoechst法或四甲基偶氮唑盐(MTT)法测定细胞的凋亡情况。2、RAP对脑皮层线粒体功能的影响：将9只3月龄雄性SHR-SPs随机分为3组,分别给予RAP 1μg/kg、1 mg/kg和溶媒DMSO,连续i.p.给药1周后取大脑皮层细胞,分别用Mitotracker GreenFM、JC-1和Dihydrorhodamine123染色后,流式细胞术检测,观察RAP对SHR-SP大脑皮层细胞的线粒体数量、膜势能和活性氧(ROS)水平的影响。实验五：研究微量RAP保护缺血性脑损伤的分子机制：1、蛋白质磷酸化芯片：将2只雄性SHR-SPs分为2组分别给予RAP 1μg/kg和溶媒DMSO,5小时后取大脑皮层,做蛋白质磷酸化芯片,寻找在RAP微量给药时磷酸化水平有较大变化的蛋白。2、微量RAP对SHR-SP脑皮层mTOR蛋白磷酸化水平的影响：将9只雄性SHR-SPs随机分为3组,分别给予RAP 1μg/kg、1 mg/kg和溶媒DMSO5小时后,取大脑皮层,Western-blot方法检测mTOR蛋白Ser2448位点磷酸化水平的变化。3、基因芯片和免疫共沉淀质谱分析：将9只雄性SHR-SPs随机分为3组,分别给予RAP 1μg、1 mg/kg和溶媒DMSO,连续给药1周后,取大脑皮层做基因芯片和免疫共沉淀质谱分析,检测大脑皮层细胞的凋亡和氧化应激相关通路上蛋白的mRNA基因表达情况,寻找微量RAP给药时与mTOR特异结合的下游蛋白。实验结果：一、微量RAP (1-10μg/kg)预防性给药能明显减轻SHR-SP的脑梗死面积,对急性缺血性脑损伤有很好的保护作用。二、微量RAP (0.2-20μg/kg)预防性给药能明显减轻C57小鼠的脑梗死面积,但当给药剂量增加至200μg/kg及以上时,RAP对急性缺血性脑损伤保护作用消失,反而使C57小鼠的体重减轻,状态萎靡。三、微量RAP (3μg/kg)长期给药能显著地延缓SHR-SP脑卒中的发生,延长其寿命。四、RAP在一定浓度范围内能显著减少氧化应激造模和MPP+造模引起的原代神经元细胞的凋亡。另外,微量RAP(1μg/kg)能显著增加SHR-SP的大脑皮层细胞的线粒体数量,增加线粒体的膜势能,减少ROS的产生,1mg/1kg给药剂量下的作用则不明显。五、微量RAP保护缺血性脑损伤的分子机制1、蛋白质芯片结果显示：与对照组相比,微量RAP (1μg/kg)组,mTOR信号通路上,mTOR的上游蛋白AMPK、AKT、PDK1和下游蛋白S6K1和4EBP1的磷酸化水平均有明显变化。2、Western-blot检测发现：与对照组相比,微量RAP (1μg/kg)组mTOR蛋白Ser2448位点的磷酸化水平明显上调,RAP (1 mg/kg)组的作用不明显。3、基因芯片结果显示：微量RAP给药一周后,SHR-SP的大脑皮层神经细胞在P53信号通路上,cyclinE基因表达上调,Gadd45基因表达下调。结论：1、微量RAP对急性缺血性脑损伤有很好的保护作用,长期给药能显著延缓SHR-SP脑卒中的发生,延长其寿命。2、微量RAP对缺血性脑损伤的保护作用可能与其抗氧化应激、抗凋亡、增强线粒体的功能有关。3、微量RAP的保护作用可能与mTOR蛋白有关。