胶体金免疫层析方法（Gold nanoparticle based immunochromatographic assay,Au NP-ICA）是最常见的即时诊断（point-of-care,POC）方法之一。胶体金免疫层析法的分析性能通常取决于探针的生物活性。制备胶体金探针常用偶联方法包括物理吸附法以及碳二亚胺（EDC/NHS）共价结合法。然而,以上策略不是位点特异性的偶联,抗体在Au NPs表面偶联方向的随机分布会引起抗原结合位点的遮蔽以及空间位阻效应,从而降低固定在Au NPs表面抗体的生物活性。因此,开发简单、快速的位点特异性偶联策略,实现抗体在Au NPs表面的定向分布,对于制备高性能免疫探针具有重要的意义。研究表明,抗体的Fc片段具有一些特异性基团,如碳水化合物部分、巯基、醛基以及组氨酸残基等。其中,抗体Fc区域的醛基与酰肼官能团可以通过亲核加成形成共价键。基于此,本研究建立了一种位点特异性定向偶联策略,通过在Au NPs表面修饰具有酰肼基团的配体,抗体Fc区域的醛基可与之发生特异性共价结合。通过这种策略,抗体可以竖立在Au NPs表面,充分暴露其Fab抗原结合域,实现抗体最大的生物活性。本研究选用100 nm Au NPs作为试纸条标记材料。相比于20-40 nm的Au NPs,100 nm Au NPs具有更好的光学特性,可有效地提高试纸条的检测灵敏度。随后,将一端含硫醇基团,一端含酰肼基团的双亲聚合物配体修饰在100 nm Au NPs表面获得了酰肼胶体金（hydrazide gold nanoparticles,h Au NPs）,以乙肝表面抗原（Hepatitis B surface antigen,HBs Ag）作为目标分析物,将抗HBs Ag抗体标记在h Au NPs表面制备h Au NPs探针,并进一步构建了定量检测乙肝表面抗原的免疫层析试纸条新方法。与碳二亚胺策略相比,此方法标记抗体用量更少（0.2mg/pmol）、反应时间更短（10 min）、h Au NPs探针生物活性更好,试纸条检测灵敏度更高（2 ng/m L）。此外,该试纸条定量检测HBs Ag的线性范围为2-1000ng/m L,回归方程为y=0.0026x+0.1179（R~2=0.9904）。该试纸条与血清中其他蛋白（降钙素原、卵泡刺激素、癌胚抗原、卵清蛋白、丙型肝炎表面抗原、甲胚蛋白）均无交叉反应;批内、批间回收率在86.64%-109.64%,变异系数在0.37%-1.61%;检测结果与化学发光方法相比,两者具有良好的相关性。其次,以玉米赤霉烯酮（ZEN）作为检测目标物,建立了酰肼胶体金免疫层析试纸条定量检测ZEN的方法。该方法定量检测ZEN的线性范围为0.25-250ng/m L,回归方程为y=-0.119ln（x）+0.7679（R~2=0.9845）,50%竞争抑制浓度(IC50)为9.4 ng/m L,检测灵敏度为0.32 ng/m L。该酰肼胶体金试纸条与其他常见真菌毒素（黄曲霉毒素B1、伏马菌素B1、赭曲霉毒素A、桔霉素、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素B2、脱氧雪腐镰刀菌）均无交叉反应,检测玉米加标样本的批内和批间回收率在83.1%至118.0%之间,变异系数在4.3%至13.1%之间。以上结果表明,基于酰肼介导抗体定向偶联策略可应用于夹心型与竞争型免疫层析试纸条,同时提高试纸条的检测性能。