团头鲂（Megalobrama amblycephala）是我国第六大淡水养殖经济鱼类,嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染引起的细菌性败血症对团头鲂养殖产业造成了严重的破坏。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一类内源性非编码RNA分子,在调控各种生物过程中发挥着重要的作用。已有研究报道circRNA在哺乳动物非特异性免疫反应中发挥重要调节功能,而在鱼类中的研究还非常少,仅有少数鱼类的circRNA得到了鉴定。为了探究circRNA在嗜水气单胞菌感染过程中发挥的免疫调控功能,本研究利用RNA测序技术（RNA sequencing,RNA-seq）鉴定了嗜水气单胞菌感染后不同时间点团头鲂肝脏circRNA的表达模式,通过差异分析、基因功能富集分析、ce RNA网络构建、加权基因共表达网络分析等方法综合分析预测了circRNA功能,并进一步利用q PCR、过表达与抑制和双荧光素酶报告基因系统等实验手段对分析结果进行了验证。本研究结果可以丰富硬骨鱼类circRNA信息,有助于从非编码RNA视角了解宿主的非特异性免疫调控机制,为未来有效控制病原感染和鱼类抗病性状遗传改良奠定基础。本研究主要结果如下:1.构建了嗜水气单胞菌未感染（0 h）和感染后（4 h、12 h、24 h和72 h）5个时间点共15个团头鲂肝脏circRNA文库,共产生了163.21Gb clean data,15个测序文库的基因组比对率从87.12%到94.84%不等。使用find＿circ和CIRI2预测软件共同鉴定到250个circRNA,平均长度305 bp,61.2%的circRNA在5个时间点均有表达,超过50%的circRNA来源于外显子,circRNA在每个染色体上均有分布且没有明显的分布规律。经过不同分组两两比较分析,得到106个差异表达circRNA,它们的亲本基因富集到了Fcγ-R介导的吞噬作用、补体和凝血级联反应和趋化因子信号通路等通路,表明这些差异表达circRNA可能在免疫调控中发挥重要作用。此外利用PCR对12个随机选择的circRNA进行了成环验证,利用q PCR对6个随机选择的circRNA的表达趋势进行了验证,结果表明转录组数据可靠。2.利用mi RNA靶关系预测软件发现208个circRNA具有mi RNA结合位点,可以结合到162个mi RNA,共产生了1172条circRNA-mi RNA靶向关系。通过联合免疫相关的mi RNA-m RNA网络,构建了团头鲂肝脏中的ce RNA免疫调控网络。该网络包括139个circRNA,39个mi RNA和72个免疫相关的m RNA。网络内包括有白介素、补体、干扰素和趋化因子等在抵抗细菌感染中发挥重要作用的靶基因,说明circRNA参与到了抵抗细菌感染的免疫调控。3.将249个circRNA和7135个m RNA联合进行了加权基因共表达网络分析,根据基因表达量的相关性构建聚类树并划分模块,得到13个基因共表达模块,其中发现5个和嗜水气单胞菌感染高度相关的模块（lightpink4、darkgreen、salmon4、honeydew1和plum1）。功能富集分析发现这些特异性模块功能主要和病原体的识别、趋化因子的活化、激活炎症反应、氧气运输、血管生成、铁离子平衡以及凝血和补体激活等相关,这些结果可以预测模块内circRNA的功能,同时有助于理解鱼类抵抗细菌感染的免疫应答机制。4.预测发现circPGAP2和circEPB41L2含有mi R-146a的结合位点,利用双荧光素酶报告基因系统验证了circPGAP2可以靶向结合mi R-146a,另外利用发散引物和聚合引物验证了circPGAP2为环状RNA,circPGAP2在血液中的表达量最高,亚细胞定位显示circPGAP2主要存在于细胞质。综上,circPGAP2可能作为mi R-146a的分子海绵参与下游免疫基因调控。5.预测发现circARHGEF15和circAKT2含有mi R-214的结合位点,利用双荧光素酶报告基因系统验证了circARHGEF15和circAKT2均能靶向结合mi R-214,亚细胞定位显示circARHGEF15和circAKT2均主要位于细胞质,说明circARHGEF15和circAKT2具有成为mi RNA海绵的基础。进一步双荧光素酶报告基因系统证明mi R-214可以靶向结合hepcidin。在L8824细胞上过表达和抑制mi R-214后,hepcidin的表达分别随之下降和上升。