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随着突发性灾难事件的增多,创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)成为全球关注的热点。PTSD的本质是一系列与创伤事件相关的记忆(条件性恐惧),创伤性记忆一旦形成,很难自然消失,严重影响日常生活。暴露疗法的原理是创伤记忆的消退,但其对PTSD的疗效难以维持,表现为已消退的恐惧记忆又很快再现。提示消退保持(extinction retention)障碍可能是创伤后应激障碍发生和治疗困难的关键。既往实验表明内侧前额叶皮层(medial prefrontal cortex,mPFC)边缘下区(infralimbic area,IL)与PTSD发生、发展和治疗结局密切相关,然而,其在条件性恐惧消退保持中的作用和机制尚不清楚。我们在以往学者研究的基础上,综合行为药理学、形态学以及Western Blot方法探索条件性恐惧记忆消退的最佳“时间窗”,探讨IL区在条件性恐惧记忆消退保持中的作用及其机制,为提高并巩固PTSD治疗效果提供实验依据。为达成这一目的,设计了以下3个实验。实验一不同消退方式后条件性恐惧大鼠消退保持的动态观察目的:探讨条件性恐惧大鼠经历不同消退训练后,消退记忆保持水平的动态变化。方法:条件刺激(声音)与非条件刺激(不可逃避的足底电击)配对呈现建立条件性恐惧;随后重复呈现单独的条件刺激用于消退训练。48只SD雄性大鼠随机分为3组:对照组(自然消退,Cont组),大鼠建立声音提示的条件性恐惧而不进行消退训练;立即消退组(Imme EXT),建立条件性恐惧后15min进行消退训练;延迟消退组(EXT组),建立条件性恐惧后24h进行消退训练。以上三组大鼠一半于建模后第1、3、7、20天测试僵立行为(大鼠连续10min内僵立时间百分比);另一半分别于消退后第1、3、7、20天通过高架十字迷宫测试焦虑行为。结果:①Cont,Imme EXT和EXT组僵立行为基础值的差异无统计学意义(P>0.05)。EXT组的消退效果好于Imme EXT和Cont组(P<0.001),其远期消退效果持续稳定;EXT组大鼠消退后第1、3天的僵立行为显著下降(P<0.01),第7天已接近正常水平。Imme EXT组和Cont组间消退效果的差异无统计学意义(P >0.05)。各组大鼠在消退后7-20天僵立行为的变化无统计学意义(P>0.05)。②Cont,Imme EXT和EXT组的开放臂进入次数百分比(OA time%)和开放臂停留时间百分比(OA time%)基础值差异无统计学意义(P >0.05);在消退后不同时间点,OA entries%和OA time%两个指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。总体来说,各组动物随实验天数延长其焦虑水平逐渐降低,但各组之间在同一时间点上的焦虑水平的改变无统计学意义(P >0.05)。结论:不同的消退训练方式对条件性恐惧大鼠的远期消退效果不同,延迟消退训练方式效果最好。同时,由于不同处理组大鼠的焦虑水平类似,排除了立即消退组僵立评分值较高是焦虑水平升高所致。实验二条件性恐惧消退保持过程中IL区磷酸化CREB的动态变化目的:探讨条件性恐惧大鼠经历不同消退训练后,消退记忆保持过程中,IL区pCREB的变化。方法:实验一观察到条件性恐惧延迟消退训练效果好于立即消退训练,且消退后1-3天的消退效果最为明显。本实验采用声音-足底电击配对(条件恐惧)或非配对(非条件恐惧)刺激后,使用延迟消退方式训练大鼠,比较非条件恐惧和条件恐惧延迟消退后大鼠僵立行为变化和IL区pCREB的表达不同,同时观察条件恐惧延迟消退组在消退后1、3、7天IL区信号分子pCREB的动态变化。将SD雄性成年大鼠随机分为5组:空白组(Naive组,无任何处理),假训练A组(Sham A,声音和足底电刺激不配对呈现),假训练B组(Sham B,仅有足底电刺激),条件性恐惧组(Cont组,无消退训练),延迟消退组(EXT组)。除Cont组外,其余各组均采用与实验一相同的延迟消退训练方式,在消退后24h取材; EXT组在延迟消退后不同时间点(消退后1、3、7天)取材;各组均采用免疫荧光染色及Western Blot定位和半定量检测目标蛋白pCREB的表达水平(3-4只大鼠/时间点)。免疫荧光单一标记各组IL区pCREB以说明非条件恐惧对IL区细胞pCREB表达的影响。免疫荧光三重标记分别指:pCREB显示细胞核(绿),Neu-N显示神经元胞体和胞核(红),hoechst染色细胞核(蓝)。pCREB阳性细胞同时为Neu-N阳性、hoechst阳性的进行记数。以此说明延迟消退后IL区神经元的pCREB表达水平。结果:①EXT组消退后1天僵立时间百分比(48.72±10.27)显著低于Sham A(79.65±6.88)、Sham B(77.53±6.03)和Cont组(61.12±10.22)(P<0.001),而明显高于Naive组(55.77±10.40)(P<0.01)。EXT组消退后1天(823.70±67.31)IL区pCREB阳性细胞表达显著高于Sham A(442.20±53.19),Sham B(453.20±49.47)和Cont组(564.20±55.37) (P<0.001),而低于Naive组(994.00±56.62)pCREB表达(P<0.01)。Sham A组和Sham B组的僵立时间百分比和IL区pCREB阳性细胞表达与Cont组相比差异无统计学意义(P>0.05)。②免疫荧光三重标记IL区pCREB阳性神经元表达数:在延迟消退后1天(45±5.70)、3天(62±8.39)、7天(66.2±7.59)大鼠IL区pCREB阳性表达数呈逐渐增加趋势,其中在消退后第1、3天增加迅速(P<0.001),消退后3、7天的变化无统计学意义(P>0.05),消退后第7天基本回复到正常水平。条件性恐惧组IL区pCREB阳性表达数(28±2.73)显著低于Naive组(73.2±5.31)和延迟消退组在各时间点的表达数(P<0.001)。③Western Blot结果:将β-actin表达强度作为内参,各组大鼠IL区pCREB目标蛋白表达变化如下:延迟消退组在消退后1天(0.86±0.06)、3天(1.11±0.06)、7天(1.22±0.04)的pCREB蛋白表达量持续增加(P<0.01),消退后1、3天增加尤为突出。条件性恐惧组大鼠pCREB蛋白表达显著减少到(0.54±0.03)(P<0.001)。消退后7天的目标蛋白表达与Naive组(1.39±0.05)的差异无统计学意义(P>0.05)。结论:声音提示的条件性恐惧伴随IL区内pCREB表达水平降低,而僵立行为的改善伴随IL区pCREB表达水平的逐渐增强。延迟消退后第1-3天IL区内pCREB的表达水平显著升高,且这些表达变化主要集中在IL区神经元内。提示pCREB可能参与条件恐惧的消退。实验三NMDA受体在大鼠条件性恐惧消退保持中的作用机制研究目的:观察非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801对条件性恐惧大鼠消退保持及IL区pCREB表达的影响,探讨NMDA受体影响消退保持的可能机制。方法:采用延迟消退训练方法,将雄性成年SD大鼠随机分为4组。训练前腹腔注射MK-801(Pre-MK-801)组:延迟消退训练前40min腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);训练后腹腔注射MK-801(Post-MK-801)组:延迟消退训练后4h腹腔注射MK-801(0.3 mg/kg);延迟消退组(EXT):条件性恐惧建立24h后进行消退训练,给予等量生理盐水;对照组(自然消退,Cont):只建立条件性恐惧,不进行消退训练,给予等量生理盐水。一半大鼠于消退当日(EXT-0 d)、消退后1、3、7(EXT-1、3、7d)测定僵立时间,进行条件性恐惧消退保持研究;另一半大鼠在上述时间点进行高架十字迷宫实验,以评价实验处理后大鼠在消退期间焦虑水平的变化。同样处理的大鼠在相同的时间点被处死,用于免疫荧光、Western Blot研究(3-4只大鼠/时间点)。免疫荧光三重标记分别指:pCREB显示细胞核(绿),Neu-N显示神经元胞体和胞核(红),hoechst染色细胞核(蓝)。pCREB阳性细胞同时为Neu-N阳性、hoechst阳性的进行记数。以此说明延迟消退后IL区pCREB神经元表达的水平。结果:①各组大鼠僵立行为基础值的差异无统计学意义(P>0.05)。Post-MK-801组大鼠在EXT-1、3、7天的僵立行为高于EXT组的相同时间点(P<0.01),但明显低于Pre-MK-801组和对照组(P<0.05)。Pre-MK-801组在EXT-1、3、7天的僵立行为与对照组相同时间点比较无统计学意义(P >0.05)。Cont组在EXT-7d的僵立行为低于EXT-0d(P<0.05)。在消退后各时间点上Pre-MK-801组和Post-MK-801组的僵立行为改变无统计学意义(P>0.05)。②各组大鼠进入开放臂次数百分数(OA entries%)和开放臂停留时间百分数(OA time% )基础值的差异无统计学意义(P>0.05)。在消退后不同时间点,OA entries%和OA time%两个指标的变化无统计学意义(P>0.05)。各组大鼠焦虑水平随实验天数延长有所改善,但各组之间在同一时间点上的焦虑水平的改变无统计学意义(P>0.05)。③免疫荧光三重标记IL区pCREB的神经元数表达: Post-MK-801组(42.80±4.32)IL区pCREB阳性神经元数低于EXT组(48.80±2.39)(P<0.05),但明显高于Pre-MK-801组(34.80±3.11)和对照组(35.60±4.16)(P<0.01)。Pre-MK-801组IL区阳性细胞数与对照组比较无统计学意义(P>0.05)。④Western Blot结果显示:将β-actin表达强度作为内参,不同给药方式大鼠IL区pCREB目标蛋白表达变化如下:Post-MK-801组(0.71±0.06)IL区pCREB阳性带明显低于EXT组(0.87±0.08)(P<0.01),但明显高于Pre-MK-801组(0.49±0.05)和对照组(0.52±0.03)(P<0.01)。Pre-MK-801组IL区pCREB阳性带与对照组比较其差异无统计学意义性(P>0.05)。结论:在消退训练前40min、消退训练后4h腹腔注射MK-801不影响大鼠的焦虑行为,而影响其条件恐惧消退的巩固和保持。消退训练前40min腹腔注射MK-801的消退效果明显差于消退训练后4h给药,这些行为学改变伴随IL区pCREB神经元表达水平的相应改变。大鼠IL区的pCREB可能参与了条件性恐惧记忆的建立和消退过程,MK-801可能通过拮抗NMDA受体从而减弱大鼠条件性恐惧记忆的消退保持过程。这些改变主要局限于该区的神经元,提示MK-801通过拮抗NMDA受体活性,进而减弱条件性恐惧记忆消退保持过程。