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研究背景鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumanni,AB）由于其在物体表面可长时间存活而成为院内感染的常见菌种,是引起医院获得性肺炎、呼吸机相关肺炎及其他留置导管相关感染的主要致病菌,尤其以重症监护室（Intensive Care Unit,ICU）的患者最为常见。由于鲍曼不动杆菌易产生耐药性及临床上抗菌药物使用不合理,近年来鲍曼不动杆菌的耐药问题越来越突出,特别忧虑的是其对碳青霉烯类抗菌药物的敏感性逐年下降,导致临床治疗药物的选择十分有限。国内流行病学调研显示,对碳青霉烯类耐药的鲍曼不动杆菌（Carbapenem-resistant Acinetobacter baumanni,CRAB）是呼吸重症监护室HAP和VAP的最常见病原体,患者基础脏器功能差,肺部感染程度重,但可选择抗菌药物种类少,且常需大剂量、联合和长疗程使用,但是临床疗效仍不乐观。2017年2月世界卫生组织也将CRAB列为耐药菌序列中极为重要的病菌之一。多粘菌素在国内仍未普及;替加环素的使用剂量还存在争议,且上市不久耐药进展迅速;头孢哌酮钠/舒巴坦钠+米诺环素是目前国内常用的联合治疗方案之一,临床疗效仍缺乏大规模随机对照研究。因此,亟需探索能够提高现有抗CRAB药物临床疗效的辅助方案。研究证实,健康人体的气道表面液体层（Airway surface liquid,ASL）为弱碱性,当细菌感染时则变为弱酸性。国外的研究发现ASL中的多种抗菌活性物质对pH值较为敏感,在酸性环境中其抗菌活性显著下降。本课题组前期的研究工作证实,体外培养时环境的pH值对细菌增殖有显著影响,例如培养CRAB在弱酸性环境下的增殖活性高于在弱碱性环境中。进一步的实验还发现,不同环境pH值对抗菌药物杀菌效力也存在影响,譬如在弱酸环境下头孢哌酮钠/舒巴坦钠联合米诺环素对CRAB的杀菌效果显著差于在弱碱环境中。基于此,本课题拟进一步通过在体和离体研究,验证恢复CRAB感染气道中ASL的弱碱环境,能够在抗菌药物清除耐药细菌的治疗中发挥辅助作用,并探讨其作用的分子机制。旨在为耐药菌肺部感染的临床治疗新策略提供理论依据。实验目的1.采用耳窥镜直视气管插管法构建稳定可靠的CRAB肺炎小鼠模型。2.明确恢复气道ASL碱性pH值环境对抗菌药物治疗CRAB肺炎小鼠的辅助作用。3.探讨环境pH值对ASL中抗菌活性物质抑制CRAB活性的影响及其机制。实验方法1.收集唐都医院呼吸内科监护室患者痰液标本,分离培养鉴定出鲍曼不动杆菌,并进行药敏实验,筛选出对碳青霉烯类耐药的菌株,制备菌液备用。2.采用耳窥镜直视气管插管法制备CRAB肺炎小鼠模型。将分离培养的定量CRAB菌液种植于C57BL/6小鼠气管内,检测小鼠肺部细菌负荷。3.在抗菌药物（头孢哌酮钠/舒巴坦钠+米诺环素）治疗CRAB肺炎小鼠的基础上,联合雾化吸入碱性溶液（5%NaHCO3）,观察后者对于抗感染疗效是否具有辅助作用。4.纸片法检测改变环境pH值对ASL中抗菌活性物质抑制CRAB效应的影响。5.Real-time Quantitative PCR法检测不同pH值环境中CRAB外排泵蛋白mRNA的表达水平。6.采用罗丹明6G外排实验考察不同pH值环境对CRAB外排能力的影响。7.统计学分析使用SPSS 20.0程序进行,统计方法多组计量资料使用方差分析,计数资料使用卡方检验,结果表示为平均数±标准误,P<0.05为差异有显著性。实验结果一、耳窥镜直视下气管插管法成功构建CRAB肺炎小鼠模型1.通过耳窥镜直视下气管插管技术进行研究,以10只C57BL/6小鼠为研究对象,每只小鼠分给予注射浓度为3.9×108 CFU/m L的菌液10μl（其中1只小鼠因操作不当插管而死亡）。气管插管后立刻处死所有小鼠,将肺取出并定量,其菌落计数为4.18×107±0.91×107（3.34×1074.42×107）CFU/g肺,表明该方法重复性好。2.小鼠随机分为正常对照组、免疫缺陷组和免疫缺陷合并鲍曼不动杆菌感染组三组。腹腔注射环磷酰胺制备免疫缺陷小鼠,肺炎造模的最终给予气道注射CRAB菌液浓度为2.5×108 CFU/m L,观察48h。结果显示,与正常对照组相比,在感染后即刻,免疫缺陷组和免疫缺陷感染组的小鼠中的血白细胞和中性粒细胞数的平均值已有明显下降（P<0.05）,免疫缺陷感染组在此时,平均肺内细菌数目可达1.03×106 CFU/g肺;与0h比较,4h免疫缺陷感染组小鼠,其平均肺内菌量明显升高,达到0.92×107 CFU/g肺,菌量增长10倍（P<0.05）,外周血各类炎症相关细胞计数亦升高（P<0.05）。证实该方法建立鲍曼不动杆菌肺炎小鼠模型成功。二、雾化吸入碱性溶液对抗菌药物治疗CRAB肺炎小鼠具有辅助作用1.雾化吸入碱性溶液能恢复CRAB肺炎小鼠气道ASL的正常p H。采用荧光染料方法测量正常小鼠的气道液体p H值约为6.3,与正常对照组小鼠相比,气道种植鲍曼不动杆菌处理后,其气道液体p H值显著降低（P<0.05）,而雾化吸入碱性溶液可恢复气道ASL正常的p H。2.雾化吸入碱性溶液与抗菌药物治疗（头孢哌酮钠/舒巴坦钠+米诺环素）的联合使用,能降低单因素干预CRAB肺炎小鼠的死亡率。在鲍曼不动杆菌感染小鼠后8h内,有30%小鼠死亡,抗菌药物治疗组小鼠死亡率为20%,而雾化吸入碱性溶液联合抗菌药物治疗组有10%小鼠死亡。48h时,感染组小鼠死亡率达80%,抗菌药物治疗组及抗菌药物治疗联合雾化吸入组小鼠死亡率分别为60%和50%。雾化吸入碱性溶液提高了抗菌药物治疗小鼠的生存率。值得一提的是,雾化吸入碱性溶液只有在抗菌药物治疗的基础上才有控制感染疗效。3.雾化吸入碱性溶液与抗菌药物的联合使用,能降低单因素干预CRAB肺炎小鼠的肺组织、肺泡灌洗液的细菌负荷。建模后8h,感染组小鼠肺组织、肺泡灌洗液的细菌负荷分别达到85.3×105和79.3×105CFU,抗菌药物治疗可显著降低其肺组织、肺泡灌洗液中的细菌负荷（P<0.05）,碱性溶液雾化吸入并不能够降低细菌负荷,但在抗菌药物治疗的基础上联合使用雾化吸入可进一步降低细菌负荷。4.雾化吸入碱性溶液与抗菌药物的联合使用,能降低单因素干预CRAB肺炎小鼠外周血液中炎症因子含量及肺泡灌洗液的白细胞计数。抗菌药物治疗和单纯感染组相比,其血液中炎症因子含量及肺泡灌洗液的白细胞计数显著降低;抗菌药物治疗的基础上联合使用雾化吸入碱性溶液,可进一步控制机体炎症反应和肺泡内炎性细胞渗出。5.雾化吸入碱性溶液与抗菌药物的联合使用,能改善单因素干预CRAB肺炎小鼠的肺组织病理改变程度。CRAB肺炎小鼠肺组织切片可见白细胞大量渗出,肺泡塌陷及细菌的定植,抗菌药物治疗组的肺组织切片的病理变化较轻。而在抗菌药物治疗的基础上雾化吸入可进一步改善CRAB肺炎小鼠肺组织病理改变。三、弱碱环境能增强ASL中抗菌活性物质对CRAB活性的抑制效应,降低细菌外排泵表达水平及功能是其主要机制之一1.强酸环境降低ASL对CRAB的抑菌效果,弱碱环境能提高ASL的抑菌作用。纸片法实验结果显示,p H为7.1时ASL抑菌圈半径最大,为13.5±2.6mm,p H为7.5时抑菌圈半径为12.8mm±2.3mm,两者无统计学差异,但p H为6.0时抑菌圈半径显著降低,为6.3±0.8mm。2.弱碱培养环境能降低CRAB外排泵基因的表达水平。比较CRAB细菌的外排泵基因分别在p H6.3、p H7.1和p H7.5培养环境中的基因表达情况。结果表明在不同p H值环境条件下,ade B、ade J的基因表达量有显著差异,与在p H6.3的弱酸性环境中相比,在p H7.1的弱碱性环境中外排泵基因ade B和ade J均显著下降,且p H7.5的碱性环境可进一步显著降低外排泵基因ade B和ade J的表达。3.弱碱培养环境能降低CRAB对罗丹明的排出能力。罗丹明6G排出实验是检测细菌胞体内残存罗丹明被排出胞体量的一种检测方法。本研究发现,细胞悬液p H6.3组细菌罗丹明排出的ES为765±48.2（n=8）,细胞悬液p H7.1组细菌罗丹明排出的ES为536±37.5（n=8）,细胞悬液p H7.5组细菌罗丹明排出的ES为468±35.4（n=8）,细菌对罗丹明的排出能力与环境p H值呈明显负相关。结论CRAB肺炎是重症患者院内感染的常见病症,经典抗菌药物治疗的临床效果差,常导致患者基础疾病的救治前功尽弃。本研究制备CRAB肺炎小鼠模型,探讨雾化吸入碱性溶液（5%Na HCO3）对抗菌药物（头孢哌酮钠/舒巴坦钠+米诺环素）治疗CRAB肺炎的辅助效应,并探讨效应机制。在体的效应研究结果发现,雾化吸入碱性溶液能恢复CRAB小鼠ASL的正常p H值至弱碱,降低动物死亡率,降低肺部细菌负荷及全身炎症反应,从而证实改善肺部p H环境能增强抗菌药物治疗CRAB肺炎的疗效。体外的机制研究结果发现,培养CRAB的干预实验证实,弱碱环境能提高小鼠气道ASL对CRAB的抑菌效应,可能与ASL中抗菌活性物质在恢复正常的p H值环境中抗菌活性恢复有关;碱性培养环境还能改变CRAB细菌ade B、ade J及外膜蛋白car O基因的扩增曲线,使得ade B、ade J的m RNA表达水平显著下降,从而在一定程度上促进了抗菌药物对耐药菌活性的抑制效应。这些研究结果将为提高临床治疗CRAB肺炎的疗效,提供新的潜在辅助方案。