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背景：结直肠癌（colorectal cancer，CRC）在我国乃至全球范围内已成为最常见的恶性肿瘤之一；转移与复发是目前临床上治疗CRC所面临的主要难题。目前大量的研究认为Wnt信号通路在CRC的发生、发展中发挥了十分重要的作用；Wnt信号通路上多个组分的改变与结直肠癌发病密切相关，但其中的作用机制十分复杂，尚不完全清楚。肝癌缺失基因（Deleted in liver cancer-1，DLC-1）是新近发现的一个候选抑癌基因，能够影响肿瘤细胞内一系列的信号转导通路。DLC-1的低表达或表达缺失与CRC的发生、发展以及肿瘤细胞的侵袭、转移能力密切相关。目前的研究认为，不同的细胞信号通路之间存在着复杂的串话作用（Crosstalk）。有研究发现DLC-1可能对Wnt信号通路靶基因cyclin D1的表达有抑制作用，说明抑癌基因DLC-1对Wnt信号通路可能发挥负向调控作用，具体的机制尚未阐明，尚有待进一步研究，而目前此方面的报道尚很少。目的：本课题拟通过构建携带抑癌基因DLC-1（deleted in liver cancer-1）的重组慢病毒表达载体并用其感染阴性表达DLC-1基因的结直肠癌SW480细胞，实现DLC-1基因在结直肠癌SW480细胞中的过表达，从而检测利用重组慢病毒导入的DLC-1基因过表达对结直肠癌SW480细胞的生物学行为及Wnt信号通路相关基因表达水平的影响。方法：1.根据Genebank数据库（基因号NM006094.4）确定DLC-1基因的靶序列并人工合成。2.利用限制性内切酶及DNA连接酶将DLC-1基因的靶序列按特定方向构建到真核表达载体质粒pcDNA3.1（+）-GFP中，形成重组质粒pcDNA3.1（+）-GFP-DLC-1。3.用双酶切法对重组质粒的阳性克隆进行鉴定，同时将阳性克隆进行基因测序验证其构建的正确性。4.在LipofectamineTM2000介导下重组质粒pcDNA3.1（+）-GFP-DLC-1与慢病毒包装质粒pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，包装慢病毒颗粒。5.用荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白（GFP）的表达并计算重组慢病毒的滴度。6.用重组慢病毒感染结直肠癌SW480细胞，用流式细胞仪检测其感染率。7.采用Real-time PCR及Western blot分别检测SW480细胞中DLC-1mRNA和蛋白的表达水平。8.用MTT法检测SW480细胞的增殖活性；流式细胞仪检测细胞周期及凋亡细胞数；平板克隆形成实验检测SW480细胞的克隆形成能力；Transwell小室法检测SW480细胞迁移和侵袭能力。9.将转染DLC-1基因的SW480细胞进行传代培养，建立稳定的转染细胞株。10.最后，用Real-time PCR及Western blot检测转染DLC-1基因的SW480细胞中Wnt信号通路相关基因GSK-3β、c-myc和β-catenin的表达水平。结果：1.双酶切法鉴定及基因测序结果均证实重组质粒pcDNA3.1（+）-GFP-DLC-1构建正确。2.在荧光显微镜下观察到293T细胞产生的绿色荧光；测得病毒滴度为1x109UT/ml；慢病毒对SW480细胞的感染率为90%，感染率较高。3. Real-time PCR结果显示，重组慢病毒组DLC-1mRNA的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001），阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。4. Western blot结果显示，重组慢病毒组DLC-1蛋白的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001）；阴性对照组与空白对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。5.转染DLC-1基因后的SW480细胞其增殖活性降低（P＜0.01），克隆形成率降低（P＜0.01）；细胞周期被阻滞在G1期（P＜0.01），凋亡细胞显著增多（P＜0.01）；Transwell实验表明SW480细胞的迁移、侵袭能力均被抑制（P＜0.01）。6. Real-time PCR结果显示，重组慢病毒组GSK-3β mRNA的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重组慢病毒组β-Catenin mRNA的表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重组慢病毒组c-myc mRNA的表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。7. Western blot结果显示，重组慢病毒组GSK-3β蛋白的表达水平显著高于阴性对照组和空白对照组（P＜0.0001），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重组慢病毒组β-Catenin蛋白的表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组（P<0.01），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；重组慢病毒组c-myc蛋白的表达水平显著低于阴性对照组和空白对照组（P<0.001），空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：成功构建了DLC-1基因的重组慢病毒表达载体，其携带的DLC-1基因能够在结直肠癌SW480细胞中过表达，DLC-1基因的过表达能够抑制结直肠癌SW480细胞的增殖、克隆、周期、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为，同时还对SW480细胞中Wnt信号通路关键基因的表达有抑制作用。这为进一步研究DLC-1抑制Wnt信号通路的分子机制奠定了理论依据和实验基础，为研发结直肠癌的靶向治疗药物提供了新的思路。