过敏性休克是全身过敏反应中最严重的表现,经典免疫学教材将其定义为为IgE抗体介导的Ⅰ型速发型超敏反应。Ⅰ型超敏反应的具体发生机制为:变应原特异性IgE抗体结合嗜碱粒细胞或肥大细胞表面的高亲和力IgE的Fc受体(FcεRI),该细胞即为致敏状态；当相同的变应原再次进入机体并与致敏的嗜碱粒细胞和肥大细胞表面的特异性IgE结合,可导致嗜碱粒细胞与肥大细胞脱颗粒,释放一系列炎症介质,如白三烯、组胺、血小板活化因子(PAF)及蛋白酶等；这些介质可使机体平滑肌收缩,毛细血管扩张,血管通透性和腺体分泌增加等,从而引起局部或者全身的炎症反应。诱发Ⅰ型超敏反应的主要变应原包括食物,花粉,药物及异种血清等。过敏性休克常见于临床上的药物过敏,如最经典的青霉素过敏,其特点是反应迅速,抗原进入机体后数分钟内即可促发反应,极短时间内血容量急剧减少,引起低血压、休克、甚至死亡。为此,长期以来,对包括过敏性休克的Ⅰ型超敏反应的研究、预防及治疗多围绕IgE途径展开。　　 然而,近年的大量研究表明Ⅰ型超敏反应还存在着一条IgG抗体介导的替代途径。人们发现用在肥大细胞缺陷,IgE缺陷或者FcεRI缺陷小鼠仍能诱导出全身过敏反应,而且只有当IgE和IgG两种受体同时缺陷的小鼠才不能出现全身过敏反应；同时也发现IgG类抗体的存在对人的过敏反应也有一定的意义。由此可见,IgE通路并不能解释所有的过敏现象,因而探索IgG类抗体在过敏反应中的真正作用是十分必要的。对小鼠全身过敏模型中IgG介导的通路的研究发现,IgG型抗体与变应原复合物可能是通过与嗜碱性粒细胞或巨噬细胞表面的FcγRⅢ结合,使细胞迅速释放血管活性介质所引起,这类介质以血小板活化因子(PAF)为主,其生物学活性比组胺强,可使机体在极短时间内出现血容量减少,血压降低甚至休克症状。但该途径的发生机制仍有许多未知待阐明。　　 目前用于研究全身过敏反应的动物模型包括主动过敏反应模型和被动过敏反应模型,主动过敏反应模型是模拟过敏反应病理过程,先用抗原免疫动物,再给抗原攻击使动物产生过敏反应,这类模型的变应原包括半抗原和完全抗原,需要加用佐剂及一定的免疫周期。被动全身过敏反应模型为提前数小时至数十小时用抗体致敏动物,再予以抗原攻击,此类模型虽有别于自然发生及主动免疫的过敏反应,但所诱发的基本病理反应与主动过敏反应相同,尤其是用纯化抗体及单克隆抗体使实验条件易于控制,不需耗时的免疫周期,是一个简单、快速而有效的实验模型,为研究IgG介导的过敏反应提供了便利。现已报道的IgG被动致敏模型的变应原基本采用半抗原,如TNP(三硝基苯),DNP(二硝基苯),青霉素等。此类模型在抗体制备,尤其在诱发过敏的攻击时均需将半抗原交联载蛋白如OVA(卵清白蛋白),BSA(牛血清白蛋)等,不但增加了实验步骤,且增加了载体蛋白这一可能的影响因素。此外,虽然半抗原一载体交联物作为变应原具有表位明确的优点,但该被动致敏模型除其诱导反应相当缓慢,症状较轻外,对于阐明临床上许多天然的完全抗原所诱导的过敏现象仍有一定的局限性。　　 因此,用针对天然的完全抗原的IgG型抗体建立体内全身被动过敏性休克模型是十分必要的。而且基于IgG型抗体在体内含量较高,即具备了用纯化抗体、甚至用单克隆抗体进行被动致敏并诱发休克的可能性与可行性。用单抗建立过敏性休克模型不但具备识别表位明确,且使实验条件更易于控制。本研究主要目的是建立一个用于研究IgG型抗体介导被动过敏性休克的模型与平台,即输入抗体后以抗原攻击可立刻发生过敏性休克。具体工作包括用经典的变应原鸡卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA)制备出IgG类单克隆抗体,用这类单克隆抗体和OVA建立天然完全抗原被动过敏性休克模型,并对其作用机理做初步的探索。这一工作将为揭示IgG型抗体诱发过敏反应机制,研究有效的干预手段,加快研发速度提供必要的工具与平台。　　 第一章 IgG类抗OVA单克隆抗体的制备和鉴定　　 以OVA为免疫原免疫Babl/c小鼠,四次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(NS-1)融合,经HAT选择培养、ELISA筛选和三次克隆化获得了可稳定分泌抗OVA不同表位单克隆抗体的10株杂交瘤,分别命名为:1A6,2C2,4C10,4F1,588,1D1,3C10,3H8,6H4,5G12,其中8株为IgG1(1A6,2C2,4C10,4F1,588,1D1,3C10,5G12),2株为IgG2a(3H8,6H4)。扩大培养后制备腹水,用辛酸硫酸铵沉淀法从腹水中纯化抗体。经ELISA鉴定,结果显示10株抗体的检出灵敏度虽有所不同,但均能与OVA特异性结合,且与源于其他种属白蛋白如牛血清白蛋白BSA,人血清白蛋白(HSA),小鼠血清白蛋白(MSA),兔血清白蛋白(RSA)无交叉反应。Western Blot(WB)鉴定结果显示,在非变性条件下,所有抗体均能与OVA蛋白有效结合；但在变性条件下,抗体4F1与OVA.不发生反应；2C2,5G12,6H4等3株抗体在变性WB中以二巯基乙醇(2-ME)还原及非还原状态下与OVA的反应成分有所不同；抗体4C10,1D1,3C10,3H8与商品化抗OVA单克隆抗体A6075的WB结果相似。　　 此部分工作成功的获得了10株抗OVA特异性单克隆抗体,为后续的被动全身过敏模型的建立奠定了基础。　　 第二章 IgG类单抗介导被动过敏性休克模型的建立　　 经对10株单抗单独与组合致敏鉴定及条件优化,确定单抗2C2,5G12,6H4单独用于致敏可成功建立被动过敏性休克模型。该模型适用于昆明鼠、Balb/c及C57/CL6小鼠,以纯系小鼠更为敏感,且个体差异较小。模型建立的条件为:6-8周龄Balb/c小鼠,平均体重20g,尾静脉注射单抗100μg,4h后,静脉给OVA 5mg/kg进行攻击,攻击后10min内小鼠出现过敏性休克现象(低体温),最大降温幅度可达6度(低于32℃时测不出),低体温状态维持1h以上与生理盐水组相比,肛温变化有显著性差异(P<0.05)。其他株抗体单独及组合使用均不能诱导出过敏的现象,且组合应用亦不能阻断或影响2C2,5G12,6H4的被动致敏作用。　　 本章工作成功地建立了稳定的IgG抗体被动致敏的过敏性休克模型。所用抗体及抗原量低,休克反应发生迅速,实验重复性好。由上述工作产生的问题是:为什么同是OVA特异性IgG型单抗,仅有少部分可诱导过敏性休克,且不被其它相同特异性抗体所阻断?诱发被动过敏的机制是什么?此外,我们还发现用单抗与变应原在体外混合后静脉注射可使小鼠更为迅速地产生过敏性休克,体温在20 min内降4-5℃。为此,也提示我们有必要探索是否由抗原抗体复合物在体内激活补体所诱发过敏反应,或补体加重了过敏反应。　　 第三章 IgG抗体介导被动过敏性休克的机制初探　　 采用具被动致敏作用的单抗2C2为代表对其诱导被动过敏性休克的机制做了初步探讨,具体包括:(1)IgG型抗OVA抗体或抗体一抗原复合物通过何种细胞发挥作用。预先给予Babl/c小鼠一定量的抗OVA单克隆抗体(2C2),采用标记FITC的OVA(FITC-OVA)作为攻击抗原,注射抗原15 min后取小鼠外周血抗凝标本、腹腔巨噬细胞。经染色处理后上流式细胞仪分析,结果显示小鼠体内粒细胞中的一群细胞能有效结合抗原,与文献报道结果相似,而腹腔巨噬细胞结合抗原并不明显；通过对CD49b和IgE的双标流式检测,证明了2C2单抗-OVA复合物主要结合外周血中的嗜碱性粒细胞；(2)确定导致过敏性休克的主要生物活性介质。在用单抗2C2被动致敏小鼠被动后,OVA静脉攻击前给予适量的组胺及PAF拮抗剂。结果显示:抗PAF抗体可阻断2C2诱发的过敏性休克,与未干预组比较,其攻击后体温下降缓慢且幅度较小,攻击后各时间点比较肛温变化有均有显著性差异(P<0.05),提示该反应的主要生物活性介质为PAF,(3)IgG单抗-OVA复合物所诱发过敏性休克是否与血清补体有关。即瞬间进入体内并形成的抗原一抗体复合物是否可通过激活补体诱发或加重被动过敏的症状。本实验采用补体C3敲除小鼠予以证实。实验结果表明:C3敲除小鼠的被动过敏反应发作程度与野生型小鼠无明显区别。该结果提示2C2-OVA复合物诱导的被动过敏性休克与补体的作用基本无关,即并非是抗原.抗体复合物激活补体所致。　　 综上,本课题获得了10株针对OVA不同表位的IgG型单克隆抗体,其中3株(2株为IgG1,1株为IgG2a)经变应原攻击后可诱发小鼠的过敏性休克。本文重点对其中的单抗2C2做了系统研究,证明其与现有报道比较其特点在于:过敏原为天然完全抗原；被动致敏的抗体及攻击抗原的剂量均显著低于文献报道的半抗原模型,发作速度快,且不为其他IgG型抗OVA抗体所阻断；初步揭示其效应细胞为嗜碱性粒细胞,主要生物活性介质为PAF,该反应与补体无关。