目的：为了证实肝细胞癌中miR-203是否能通过靶向调控生存素来抑制肝细胞癌的增殖。研究背景：肝细胞癌肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）是世界上第五大恶性肿瘤五年生存率为9%。该病男性多于女性，在东亚的发病率最高。最近的研究显示在过去20年中该病在美国和英国发病率都有显著提高。目前，肝癌的发病原因还不是十分清楚，尽管一小部分肝细胞癌可以手术治疗，且被公认为治疗肝癌的首选方法，但大多数晚期肝癌的存活几率仍然很小。从肿瘤学观点看，肝移植应该是最理想的手术方法，但是，肝移植存在许多缺陷，比如肝源的制约，术后移植排斥反应，还有感染、胆道并发症，以及昂贵的经济费用等。不好的预后源于肝细胞癌经常复发和转移。不良的临床结果削弱了对肝细胞癌基因治疗研究的信心，以及降低了对转录激活癌基因信号通路研究的重要性。miR-203miR-203（微小RNA-203）属于miRNA表达谱中一员，是一类非编码的小RNA，被认为是基因表达调节因子，通过靶mRNA分子的3’非编码区，在翻译水平上特异性抑制基因表达或促使靶mRNA的降解。最近数据表明，miRNA参与肿瘤的生成、浸润和凋亡。miRNA-203不仅参与胚胎期表皮分化的调控、构建皮肤保护层，而且与牛皮癣、银屑病等皮肤性疾病有关，人们把miRNA-203作为致癌或抑癌因子与靶基因共同作用来参与肿瘤细胞的增殖分化、侵袭转移和凋亡等。有报道称miRNA-203在前列腺癌造血系统肿瘤和结肠癌中低表达。其他研究还表明低表达的miRNA-203参与了头颈部鳞状细胞癌，慢性髓系白血病和B细胞白血病的肿瘤细胞生成。近来，研究中发现miR-203在肝癌组织中表达明显下调，有望成为肝细胞癌的一种新预测标记，也可能成为一个潜在的治疗靶基因。生存素生存素（Survivin）是一种有多重任务的凋亡抑制蛋白，参与细胞增殖，抑制凋亡并在肿瘤发生中起着重要作用。生存素可以对抗有丝分裂期细胞的错误凋亡。它在有丝分裂和细胞移动中染色体的排列、分离起着重要作用，又是染色体移动复合体的重要调节因子。是CASP3和CASP7的抑制剂。生存素基因治疗具有良好的靶向性、特异性和安全性。生物信息学基因组预测提示：生存素可能是miRNA-203的靶向基因之一。生存素的高表达也出现在肝癌组织内。本研究旨在揭示肝细胞癌中miRNA-203是否能通过靶向调控生存素而抑制肝癌细胞的增殖。方法利用网络资源（网址http://www.targetscan.org）来预测潜在的miR-203的靶点，关键词是‘hsa-mir-203’搜索。把miR-203模拟物转染进入HepG2细胞系来增强miR-203的表达，同时把miR-203抑制物转染进入HepG2细胞系来抑制miR-203的表达。在miR-203分子水平上进行Q-PCR定量分析，再通过westernblot方法来检测miR-203对HepG2细胞系生存素表达的正向调控和负向调控的作用。最后用CKK-8测试评估在HepG2细胞系增殖中miR-203和生存素的表达量。所有数据经SPSS16.0软件分析，计量资料都采用以平均值±标准差的形式表示。组间计量资料应用t检验和方差分析法计算数据中的差别，p <0.05被认为有统计学意义。结果为了查找miR-203的mRNA靶点，我们利用靶点浏览器5.2来完成miR-203靶点的预测，生存素被预测为miR-203的一个靶点，人们发现miR-203所绑定的位置在生存素的3’UTR（nt1034-1041）上保存。为了研究miR-203与生存素在HepG2细胞上的功能关系，我们利用Q-PCR定量分析发现：对miR-203模拟物的转染使得miR-203的表达增加了400%，然而对miR-203抑制剂的转染使miR-203的细胞内水平降低了80%（p<0.05）。再通过western blot蛋白分析结果显示：当miR-203呈高表达时生存素表达显著下调，但是miR-203被抑制时生存素的表达没有显著变化。统计分析得出：在HepG2细胞系中miR-203高表达显著地抑制了生存素的表达（p<0.05），而miR-203的低表达时生存素的表达无显著变化（p>0.05）。最后利用CCK-8检测发现：miR-203的抑制作用对HepG2细胞增殖无影响（p>0.05），然而miR-203高表达显著降低HepG2细胞的增殖（p<0.05）。Q-PCR的结果还显示：在生存素siRNA转染HepG2细胞24小时后生存素的表达量下降80%（p<0.05）。HepG2细胞系的增殖与生存素受抑制作用之间关系是通过CCK-8来检测研究。研究结果表明：抑制生存素表达显著降低了HepG2细胞的增殖（p<0.05）。讨论研究肝细胞癌的分子机制是治疗的基础。越来越多的证据表明miRNA的失调参与了肝癌的进展。我们和其他研究组发现miRNA在肝癌组织中低表达，说明它参与了肿瘤的发生。然而miRNA-203的具体功能还不清楚。本研究用实时定量PCR来比较肿瘤和正常组织中miRNA的表达情况。与过去报告的一致，miRNA-203在肿瘤组织中表达下调。而与之对应的生存素含量升高。miRNA-203可能是生存素的靶向基因。然而miRNA-203和生存素在肝癌发生中的作用和功能关系在以往的研究中并没有表明。为了证实在肝细胞癌中生存素受调节于miRNA-203，我们用miRNA-203的模拟物转染HepG2细胞上调了miRNA-203的表达。结果显示：miRNA-203高表达时生存素显著下调。我们进一步检测了miRNA-203和生存素对肝癌细胞的作用。结果显示miRNA-203高表达同时生存素受到抑制，阻碍了肝癌细胞的生长，并且两者呈负相关。这表明了两者的功能关系。但是我们的研究显示miRNA-203低表达没有引起生存素高表达，也没有能促进肝细胞癌的增殖。目前肝癌中miRNA-203的低表达机制仍然不明，需要进一步研究。结论在肝细胞癌中，当miR-203呈高表达时生存素表达显著下调，但是miR-203被抑制时生存素的表达没有显著变化；miR-203的抑制作用对HepG2细胞增殖无影响，然而miR-203高表达显著降低HepG2细胞的增殖；生存素的受抑制作用显著降低了HepG2细胞的增殖。