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背景与目的肾结石是泌尿系统的常见病和多发病,是由晶体物质在肾脏的异常聚积所致,以草酸钙(calcium oxalate,Ca Ox)肾结石最为常见。草酸钙晶体对肾小管上皮细胞的造成的损伤及凋亡是草酸钙肾结石形成的关键步骤。活性氧(reactive oxygen species,ROS)可以介导线粒体中的氧化应激,同时活性氧参与草酸钙晶体促进肾小管上皮细胞损伤及凋亡。SIRT3在清除ROS和减弱氧化损伤和线粒体功能障碍中起重要作用,并在某些肾脏疾病中发挥肾保护作用。然而,SIRT3在草酸钙肾结石中的作用和具体机制还不清楚。有研究发现,SIRT3通过上调核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1(nuclear factor erythroid-2-related actor 2/heme oxygenase-1,NRF2/HO-1)通路发挥其对神经细胞的保护功能,而NRF2/HO-1信号通路在改善肾脏疾病中的氧化应激中有着重要作用。因此,本文旨在探讨SIRT3在草酸钙肾结石中的作用,并探讨其作用机制是否与调节NRF2/HO-1信号通路有关。方法1.临床水平探究肾结石患者肾组织凋亡和SIRT3、NRF2/HO-1通路的表达收集草酸钙肾结石患者的肾组织作为病例组,因肾肿瘤进行肾切除的患者的相邻非肿瘤肾组织用作正常组。采用TUNEL染色检测肾组织细胞凋亡。采用免疫组化检测两组患者肾组织中SIRT3的表达差异。采用western blot检测肾组织中SIRT3、NRF2、HO-1、Bax的蛋白水平。2.体外探究SIRT3是否通过激活NRF2/HO-1通路抑制HK-2细胞中Ca Ox晶体-细胞粘附和凋亡人肾近曲小管上皮细胞HK-2细胞分别做以下处理:(1)以草酸钙一水合物(COM,100μg/m L in DMSO)和从人体内分离的草酸钙粉碎后的纳米级的草酸钙晶体(Ca Ox,100μg/m L in DMSO),分别刺激HK-2细胞。(2)HK-2细胞转染pc DNA3.1-SIRT3和pc DNA3.1 vector,然后用COM(100μg/m L in DMSO)刺激HK-2细胞。(3)HK-2细胞转染pc DNA3.1-SIRT3或对照空载pc DNA3.1 vector,再转染si-NRF2或对照si-Ctrl,然后用COM(100μg/m L in DMSO)刺激HK-2细胞。检测指标:以上细胞处理72 h后,在光学显微镜下观察细胞表面晶体黏附情况。流式细胞术检测细胞凋亡。Western blot分别检测细胞中SIRT3、NRF2、HO-1、Bax的表达水平。3.小鼠体内探究SIRT3过表达对乙醛酸盐诱导的肾结石小鼠的肾组织凋亡、损伤和晶体沉积的影响将C57BL/6雄性小鼠分为对照组(给予生理盐水),模型组(通过每日腹腔注射给予100 mg/kg乙醛酸盐,连续7天给药),LV-Ctrl组(通过尾静脉注射对照慢病毒)和LV-SIRT3组(通过尾静脉注射SIRT3过表达慢病毒)组。一周后,分离小鼠肾脏,HE染色观察肾组织病理变化。von-kossal染色观察草酸钙晶体在肾小管管腔内的黏附情况。免疫组化检测肾脏组织细胞内SIRT3表达。TUNEL染色检测细胞凋亡情况。Western blot检测肾组织内SIRT3、NRF2、HO-1、Bax的表达。结果1.肾结石患者肾组织细胞凋亡增加,SIRT3下调,NRF2/HO-1通路活化SIRT3的免疫组化和western blot结果表明,肾结石患者的肾组织中SIRT3表达水平显著低于对照组。TUNEL染色结果表明肾结石患者的肾组织的TUNEL阳性细胞数量显著高于对照组。Western blot结果表明,肾结石患者的肾组织中促凋亡蛋白Bax的表达显著高于对照组。此外,肾结石患者的肾组织中NRF2和HO-1的表达显著高于正常对照组,提示肾结石肾组织中NRF2/HO-1通路活化。2.SIRT3通过上调NRF2/HO-1信号通路抑制HK-2中草酸钙晶体-细胞粘附和凋亡相比于DMSO组(溶媒),COM组和Ca Ox组中草酸钙晶体在HK-2细胞表面上的粘附增强、细胞凋亡增加、SIRT3蛋白水平降低、NRF2和HO-1的蛋白表达增加。过表达SIRT3抑制HK-2细胞中COM处理下的草酸钙晶体-细胞粘附和细胞凋亡,同时活化NRF2/HO-1信号通路。更重要的是,NRF2敲低有效地减弱了SIRT3对COM处理下的草酸钙晶体-细胞粘附和细胞凋亡的抑制作用。3.SIRT3过表达减轻乙醛酸盐诱导的小鼠肾组织凋亡、损伤和晶体沉积与对照组小鼠相比,肾结石模型小鼠的肾组织中可观察到明显的肾损伤(HE染色)、显著增多的晶体沉积(von-kossal染色)和TUNEL阳性细胞数(TUNEL染色)以及促凋亡蛋白Bax的水平(Western blot)。这些结果表明肾结石小鼠模型被成功构建。而相比LV-Ctrl,Lv-SIRT3注射可显著增加肾结石模型小鼠肾组织中SIRT3的表达,减轻了乙醛酸盐诱导的肾结石小鼠肾组织凋亡、损伤和晶体沉积,同时上调了小鼠肾组织中NRF2和HO-1的蛋白水平。这些结果表明了SIRT3体内过表达介导的减轻肾结石损伤作用可能与上调NRF2/HO-1信号通路有关。结论1.肾结石患者的肾组织凋亡增加,SIRT3下调,NRF2/HO-1通路活化;2.SIRT3通过上调NRF2/HO-1信号通路抑制HK-2中草酸钙晶体-细胞粘附和凋亡;3.SIRT3过表达减轻乙醛酸盐诱导的小鼠肾组织凋亡、损伤和晶体沉积。