研究背景胃癌在人类常见癌症中排名第五,在全球癌症致死原因中居第三位。在中国,每年约新增404,000例胃癌确诊患者,占全球总病例数的42%。多数患者在发现胃癌时已属进展期,预后较差。AKT磷酸化信号是体内调节细胞增殖、生存与凋亡及糖代谢的重要通路,异常激活与多种肿瘤的发生相关,如结直肠癌、肝癌、胃癌。该信号在胃癌中频繁可见被激活,有报道40-82%病例中出现AKT磷酸化,且与淋巴结转移相关。Sasaki T等在胃癌病例上发现p-AKT高的患者存活率显着低于其他患者的存活率。因此,AKT可成为胃癌的治疗靶点以及诊断和预后的标志物。抑癌基因PTEN是AKT磷酸化激活的负性调控因子,且是体内与肿瘤相关突变率最高的基因之一。PTEN突变可发生于该基因的任意编码区,但在磷酸酶结构域编码区多见(外显子5),其中C124S(PTEN蛋白N端第124位上的半胱氨酸被丝氨酸取代)突变致使磷酸酶活性完全丧失,G129E(第129位上的甘氨酸被谷氨酸取代)突变仅丧失脂质磷酸酶活性保留蛋白磷酸酶活性,该2处突变存在于自然形成的多种肿瘤之中。关于胃癌与PTEN的关系,现有国内外研究多集中在多种因素改变了 PTEN的表达增减从而对胃癌的发生发展造成影响。对于PTEN基因磷酸酶结构域发生上述2处位点突变而不影响PTEN蛋白表达量对胃癌的影响,缺乏详细研究。本研究在体外细胞水平验证PTEN磷酸酶结构域的该2个位点发生点突变对胃癌细胞AKT磷酸化的影响。第一部分胃癌细胞过表达wtPTEN基因对AKT磷酸化水平的影响目的研究胃癌细胞系AGS及BGC-823中过表达wtPTEN基因后对胰岛素或重组人表皮生长因子(rhEGF)刺激引起AKT磷酸化的影响。方法常规培养胃癌细胞系AGS和BGC-823,按实验设计转染野生型PTEN质粒,血清饥饿过夜后予各组细胞加入胰岛素或rhEGF刺激1Omin。最后提取蛋白进行Western blot法检测AKT磷酸化水平。结果1、AGS细胞中过表达wtPTEN抑制了 AKT磷酸化信号。胰岛素刺激时,AKT磷酸化被激活,无胰岛素刺激的AKT磷酸化未被激活;转染组的p-AKT表达(0.43±0.35)比非转染组(1.40±0.48)低,差异有统计学意义(P=0.049),相对应的PTEN表达趋势相反,差异有统计学意义(P=0.037);rhEGF刺激的细胞AKT磷酸化被激活,且转染组(0.54±0.12)的AKT磷酸化水平比未转染组的(0.95±0.09)低,差异有统计学意义(P= 0.010),相对应的PTEN表达趋势相反,差异有统计学意义(P=0.024)。2、BGC-823细胞上过表达wtPTEN同样能抑制胰岛素刺激引起的AKT磷酸化信号。转染组的AKT磷酸化水平(0.50±0.17)比非转染组(1.08±0.11)低,差异有统计学意义(P= 0.008),相对应的PTEN表达趋势相反,差异有统计学意义(P<0.001)。结论1、胰岛素或rhEGF均可刺激胃癌细胞引起AKT磷酸化信号通路激活。2、野生型PTEN质粒可转染入胃癌细胞并表达。3、胃癌细胞上过表达PTEN基因,均可抑制胰岛素或rhEGF刺激引起的AKT磷酸化信号。第二部分抑痛基因PTEN突变对胃痛细胞AKT磷酸化的影响目的研究抑癌基因PTEN磷酸酶域突变对胃癌细胞胰岛素或rhEGF刺激引起AKT磷酸化的影响。方法细胞培养同前,按实验设计分别转染脂质磷酸酶和蛋白磷酸酶活性均丧失的C124S突变体和仅丧失脂质磷酸酶活性的G129E突变体,血清饥饿过夜后予胰岛素或rhEGF刺激10min。最后Western blot法检测AKT磷酸化水平。结果1、AGS细胞转染C124S或G129E质粒,对AKT磷酸化信号的抑制作用消失。加入胰岛素或rhEGF刺激,对比未转染组,转入C124S质粒组的p-AKT表达平均值较高,但差异无统计学差异(P>0.05);转染G129E组的AKT磷酸化表达比未转染组的均值较高,但未见显著性差异(P>0.05)。2、BGC-823细胞转染C124S或G129E质粒,同样发现对AKT磷酸化水平无抑制作用。经胰岛素刺激,转染组的AKT磷酸化水平对比未转染组的未见显著性降低(P>0.05)。结论PTEN磷酸酶域N端124或129位点突变后对胃癌细胞AKT磷酸化无抑制作用,这可能参与了胃癌的致病过程,从而可能成为治疗靶点。