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目的:通过将老年人血清作用脐静脉血管内皮细胞后,观察衰老机体血清对血管内皮细胞生物学活性的影响;研究衰老机体血清对内皮细胞的炎性介质分泌的作用;了解调控内皮细胞炎性介质的NF-κB-Jmjd3信号通路的活化情况,分析其可能的表观遗传学调控机制。期望对与衰老相关性疾病的诊断及治疗提供新思路和新靶点。方法:1、研究对象的选择及分组:青年组:20~30岁健康体检者16例,平均年龄(25.60±1.97)岁;老年组:60~70岁健康体检者16例,平均年龄(66.60±4.78)岁;高龄老年组16例:80岁以上健康老年人,平均年龄(85.86±5.79)岁。取清晨空腹静脉血5ml,离心后分离血清分装后放入-80℃冰箱冷冻待用。实验时,将冷冻收集好的血清按健康青年组(25y)、健康老年组(65y)、健康高龄老年组(85y)分别混合制成3个标本池。2、脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)的分离、培养、复苏、传代、鉴定:取传代至3~5代的细胞于对数生长期进行实验,随机分组为25y,65y和85y组,分别以健康青年组、健康老年组和健康高龄老年样本池中的血清配成条件培养基作用HUVECs细胞;根据检测需要分别在不同时间点收集细胞和血清样本,进行相应的测定,每个实验重复3次。3、细胞活性分析:采用CCK8法检测各组血清处理对HUVECs活性的影响。4、细胞衰老情况分析:β-半乳糖苷酶染色试剂盒计数各组内皮细胞中衰老细胞的数量。5、细胞周期分析:采用流式细胞术分析各组血清诱导对HUVECs细胞周期的影响。6、活性氧水平分析:采用DCFH-DA探针法,运用流式细胞术检测内皮细胞的氧化应激水平。7、血管内皮细胞的修复能力分析:各研究组血清诱导HUVECs后,用划痕实验检测各组内皮细胞划痕后的修复能力。8、液相芯片技术分析血清池中炎性介质蛋白的水平。9、血管内皮细胞炎症反应和功能效应分子表达水平:运用荧光实时定量pcr(qrt-pcr)测定内皮细胞炎性介质和粘附分子的表达(il-1β,il-6,tnf-а,il-12,tgf-β,vcam,icam,enos)。10、血管内皮细胞内调控上述炎性介质和粘附分子表达的nf-κb/p65-jmjd3信号通路活性分析:采用免疫荧光染色技术观察各组血清诱导huvecs后,内皮细胞内的nf-κb/p65核表达变化,jmjd3的表达变化,组蛋白h3k27中赖氨酸甲基化水平的变化。结果:1、不同血清处理huvecs后,细胞活性的改变情况:与青年组(25y)相比,老年组(65y)、高龄老年组(85y)血清诱导后的均出现了生长抑制现象,差异有统计学意义,分别为p<0.05、p<0.01。2、血清诱导细胞衰老情况:与青年组相比,老年组血清诱导huvecs后,huvecs中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数显著增加、p<0.05;与青年组相比,高龄老年组血清诱导的huvecs中β-半乳糖苷酶染色阳性细胞数亦显著增多、p<0.0001。3、各组血清处理对huvecs周期的影响:与25y组相比,65y组s期细胞百分数减少,而85y组s期细胞数增多,推测随着年龄的增加,血清诱导内皮细胞的细胞周期紊乱,老年组s期细胞减少而高龄老年组s期细胞百分比异常增高。4、不同血清诱导huvecs氧化应激情况的分析:65y组内皮细胞探针的平均荧光强度较25y组显著增高,p<0.0001;85y的平均荧光强度亦显著增高,与25y相比,p<0.0001。5、血清对huvecs的修复能力的影响:经过24小时观察,65y和85y组huvecs均展现出明显降低的迁移修复能力。6、血管内皮细胞内调控上述炎性介质和粘附分子表达的nf-κb/p65-jmjd3信号通路活性:各研究组血清诱导huvecs2小时后,与青年组(25y)相比,老年组(65y)及高龄老年组(85y)整体荧光强度逐渐增强,nf-κb/p65表达上调、并逐渐向转胞核内聚集;jmjd3整体荧光强度逐渐增强,表达上调;内皮细胞内h3k27me3表达下调、整体荧光强度逐渐减弱;内皮细胞内h3k27me2表达上调、整体荧光强度逐渐增强。7、各组血清池中炎性介质蛋白水平:与青年组(25y)相比,老年组(65y)TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β蛋白水平高表达,高龄老年组(85y)上述炎性介质低水平表达。8、血管内皮细胞炎症反应和功能效应分子表达:各组血清诱导HUVECs 24小时后,与青年组(25y)相比,老年组(65y)TNF-α、白介素-12(IL-12)、VCAM-1基因mRNA的表达水平显著上调,P<0.01、P<0.001、P<0.001;eNOS表达水平明显下调,P<0.001;IL-6、IL-1β基因mRNA的表达水平显著下调,P<0.0001、P<0.0001;高龄老年组(85y)IL-6、IL-1β、TGF-β、eNOS基因mRNA的表达水平显著下调,P<0.0001、P<0.0001、P<0.005、P<0.0001。结论:随着年龄增加,衰老机体血清抑制血管内皮细胞活性,并显著促进内皮细胞衰老;导致内皮细胞周期紊乱;阻碍内皮细胞伤口的修复能力;同时,HUVECs的氧化应激反应明显增强;HUVECs的炎性介质及粘附分子的基因表达水平出现异常,这些现象伴随NF-κB/p65-Jmjd3信号通路的异常活化和H3K27甲基化水平的下调。NF-κB/p65-Jmjd3信号通路参与了衰老机体血清诱导内皮细胞活化、衰老和功能障碍。