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水稻OsRhoGDI2基因(AY364312)是本实验室前期通过酵母双杂交技术从水稻幼穗中分离获得的一个与ROP蛋白OsRacD相互作用蛋白的编码基因。前期构建了过表达转基因株系，研究表明，该基因过表达影响小孢子发育、降低花粉活性，导致育性降低。为进一步鉴定该基因在水稻生长发育过程中的功能，本研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术构建了OsRhoGDI2基因敲除水稻。以野生型日本晴(WT)与OsRhoGDI2基因敲除水稻(Cas9-OsRhoGDI2)为材料开展研究。
本研究基于CRISPR/Cas9技术原理，采用DNA重组技术构建了OsRhoGDI2基因敲除载体pW-T-OsRhoGDI2，并转化日本晴水稻愈伤组织，在T0代筛选获得了1株产生移码突变的纯合敲除水稻和8株杂合水稻；继续在T1代对杂合水稻进行筛选，获得了6种发生移码突变的纯合突变体。OsRhoGDI2序列比对结果显示，突变体水稻靶序列处发生了碱基缺失或替换，导致该基因产生移码突变与无义突变；氨基酸序列比对显示，OsRhoGDI2蛋白保守结构域RhoGDI丢失，翻译提前终止，生成截短蛋白，因此预期突变体水稻中将无法产生正常的OsRhoGDI2蛋白。T1代突变体靶位点特异性分析显示，5个潜在的脱靶位点均未发生突变，表明本研究所选择的编辑靶位点特异性良好。
为探究OsRhoGDI2基因敲除对水稻种子萌发的影响，本研究测定了种子萌发7天内OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的萌发率，种子萌发第7天时胚芽鞘与根长、胚芽鞘与根鲜重、胚芽鞘与根干重等指标。统计学分析结果显示，在种子萌发的第48h-72h，与对照相比，OsRhoGDI2敲除水稻表现出更低的萌发速率与萌发率；而在第72h-120h，OsRhoGDI2敲除水稻萌发速率大于对照；在第120h-168h，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的种子萌发速率无明显差异，而OsRhoGDI2敲除水稻三个株系的种子萌发率分别为98.50％，98.00％，96.00％，高于对照的萌发率(94％)，但是统计学上未达到显著水平。另外，在萌发第168h，OsRhoGDI2敲除水稻胚芽鞘与根的长度、干重均低于对照。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除有助于维持种子的休眠状态，降低种子早期的萌发速率，同时对胚芽鞘和根的生长有一定的抑制作用。
由于实验室前期发现OsRhoGDI2基因过表达导致水稻育性降低，所以为进一步探究OsRhoGDI2基因敲除是否影响水稻小孢子发育过程与花粉活性，本研究利用石蜡切片技术进行细胞学水平观察，比较了OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻小孢子发育8个典型时期的差异，结果显示，在细胞学水平上，两者没有明显的差异。利用亚历山大与碘-碘化钾染色法对成熟花粉的活性进行检测，统计学分析结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，成熟花粉活性无明显差异。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除，对小孢子发育过程没有明显影响，不影响花粉的成熟过程。
鉴于前期研究发现OsRhoGDI2过表达水稻株高增加，为探究OsRhoGDI2基因敲除对水稻株高的影响，本研究测量了OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻在幼苗期的株高与叶鞘长度。结果显示，生长第4周时，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，出现了株高与第2叶鞘降低的变化，统计学分析差异达到显著水平。由于株高和GA等植物激素关系密切，本研究采用qRT-PCR技术检测该时期水稻叶片中与GA合成和信号转导途径相关基因的表达水平，结果显示，与对照相比，OsRhoGDI2敲除水稻中参与GA合成的正调控基因CPS、KO2、GA20ox2、KAO与参与GA信号转导的正调控基因GID1、GID2表达量均下降。说明OsRhoGDI2基因敲除通过抑制GA的合成与信号转导，导致水稻幼苗期株高降低。
为进一步探究OsRhoGDI2基因敲除对成熟期水稻株高的影响，本研究测量了成熟期OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的株高。结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，株高降低且差异达到极显著水平。对其茎节进行测量，结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻的第Ⅱ与Ⅲ茎节长度与对照水稻相比更短，分别减少了19.00％与27.00％，且达到极显著差异水平。利用石蜡切片技术，对第III茎节细胞大小进行检测，结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻第Ⅲ茎节中，单位面积内细胞数目增多，但细胞长度缩短。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除，可能通过影响茎节细胞的分裂和伸长，引起茎节长度变化，导致成熟期水稻株高降低。
对成熟期水稻进行农艺学性状观测，统计学分析结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻不仅株高降低，同时千粒重与粒宽减少，均达到极显著差异水平。利用扫描电镜观察成熟期水稻种子内外颖壳，结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻内外颖壳表皮细胞的长度、宽度更短，且差异达到极显著水平。表明水稻OsRhoGDI2基因敲除，可能通过改变内外颖壳表皮细胞长度与宽度，进而影响种子粒形和千粒重。此外，统计学分析显示，两者的穗长、一级枝梗数、穗总粒数、穗实粒数、结实率等无明显差异。
本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGDI2敲除水稻，发现OsRhoGDI2基因功能涉及种子萌发、幼苗生长、株高以及种子粒形控制等过程，不仅为深入研究该基因的功能奠定了基础，也为水稻分子设计育种提供了一个新的潜在候选基因。
本研究基于CRISPR/Cas9技术原理，采用DNA重组技术构建了OsRhoGDI2基因敲除载体pW-T-OsRhoGDI2，并转化日本晴水稻愈伤组织，在T0代筛选获得了1株产生移码突变的纯合敲除水稻和8株杂合水稻；继续在T1代对杂合水稻进行筛选，获得了6种发生移码突变的纯合突变体。OsRhoGDI2序列比对结果显示，突变体水稻靶序列处发生了碱基缺失或替换，导致该基因产生移码突变与无义突变；氨基酸序列比对显示，OsRhoGDI2蛋白保守结构域RhoGDI丢失，翻译提前终止，生成截短蛋白，因此预期突变体水稻中将无法产生正常的OsRhoGDI2蛋白。T1代突变体靶位点特异性分析显示，5个潜在的脱靶位点均未发生突变，表明本研究所选择的编辑靶位点特异性良好。
为探究OsRhoGDI2基因敲除对水稻种子萌发的影响，本研究测定了种子萌发7天内OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的萌发率，种子萌发第7天时胚芽鞘与根长、胚芽鞘与根鲜重、胚芽鞘与根干重等指标。统计学分析结果显示，在种子萌发的第48h-72h，与对照相比，OsRhoGDI2敲除水稻表现出更低的萌发速率与萌发率；而在第72h-120h，OsRhoGDI2敲除水稻萌发速率大于对照；在第120h-168h，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的种子萌发速率无明显差异，而OsRhoGDI2敲除水稻三个株系的种子萌发率分别为98.50％，98.00％，96.00％，高于对照的萌发率(94％)，但是统计学上未达到显著水平。另外，在萌发第168h，OsRhoGDI2敲除水稻胚芽鞘与根的长度、干重均低于对照。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除有助于维持种子的休眠状态，降低种子早期的萌发速率，同时对胚芽鞘和根的生长有一定的抑制作用。
由于实验室前期发现OsRhoGDI2基因过表达导致水稻育性降低，所以为进一步探究OsRhoGDI2基因敲除是否影响水稻小孢子发育过程与花粉活性，本研究利用石蜡切片技术进行细胞学水平观察，比较了OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻小孢子发育8个典型时期的差异，结果显示，在细胞学水平上，两者没有明显的差异。利用亚历山大与碘-碘化钾染色法对成熟花粉的活性进行检测，统计学分析结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，成熟花粉活性无明显差异。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除，对小孢子发育过程没有明显影响，不影响花粉的成熟过程。
鉴于前期研究发现OsRhoGDI2过表达水稻株高增加，为探究OsRhoGDI2基因敲除对水稻株高的影响，本研究测量了OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻在幼苗期的株高与叶鞘长度。结果显示，生长第4周时，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，出现了株高与第2叶鞘降低的变化，统计学分析差异达到显著水平。由于株高和GA等植物激素关系密切，本研究采用qRT-PCR技术检测该时期水稻叶片中与GA合成和信号转导途径相关基因的表达水平，结果显示，与对照相比，OsRhoGDI2敲除水稻中参与GA合成的正调控基因CPS、KO2、GA20ox2、KAO与参与GA信号转导的正调控基因GID1、GID2表达量均下降。说明OsRhoGDI2基因敲除通过抑制GA的合成与信号转导，导致水稻幼苗期株高降低。
为进一步探究OsRhoGDI2基因敲除对成熟期水稻株高的影响，本研究测量了成熟期OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻的株高。结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻与对照水稻相比，株高降低且差异达到极显著水平。对其茎节进行测量，结果显示，OsRhoGDI2敲除水稻的第Ⅱ与Ⅲ茎节长度与对照水稻相比更短，分别减少了19.00％与27.00％，且达到极显著差异水平。利用石蜡切片技术，对第III茎节细胞大小进行检测，结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻第Ⅲ茎节中，单位面积内细胞数目增多，但细胞长度缩短。该结果说明，水稻OsRhoGDI2基因敲除，可能通过影响茎节细胞的分裂和伸长，引起茎节长度变化，导致成熟期水稻株高降低。
对成熟期水稻进行农艺学性状观测，统计学分析结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻不仅株高降低，同时千粒重与粒宽减少，均达到极显著差异水平。利用扫描电镜观察成熟期水稻种子内外颖壳，结果显示，与对照水稻相比，OsRhoGDI2敲除水稻内外颖壳表皮细胞的长度、宽度更短，且差异达到极显著水平。表明水稻OsRhoGDI2基因敲除，可能通过改变内外颖壳表皮细胞长度与宽度，进而影响种子粒形和千粒重。此外，统计学分析显示，两者的穗长、一级枝梗数、穗总粒数、穗实粒数、结实率等无明显差异。
本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了OsRhoGDI2敲除水稻，发现OsRhoGDI2基因功能涉及种子萌发、幼苗生长、株高以及种子粒形控制等过程，不仅为深入研究该基因的功能奠定了基础，也为水稻分子设计育种提供了一个新的潜在候选基因。