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目的通过观察清开灵对小鼠脑缺血/再灌注损伤（Ischemia-reperfusion injury,I/R）的保护作用,及对血脑屏障相关通路的影响,并从血脑屏障的干预作用角度探讨其抗脑缺血的作用机制。方法1.雄性C57bl/6小鼠130只,随机分成四组:假手术（Sham）组、模型缺血（Ischemia）组、清开灵（QKL）组(3ml·kg-1)、依达拉奉（EDA）组(3ml·kg-1)。通过制备MCAO小鼠模型,采用神经功能评分法评定神经功能缺损;TTC染色法测定脑梗死体积;HE染色法,观察神经胶质细胞的形态学变化;尼氏染色法,观察尼氏小体的情况。进而探究清开灵对小鼠I/R的保护作用。2.雄性C57bl/6小鼠120只,随机分成四组:假手术（Sham）组、模型缺血（Ischemia）组、清开灵（QKL）组(3ml·kg-1)、依达拉奉（EDA）组(3ml·kg-1),通过制备MCAO小鼠模型,通过双光子显微镜活体动态观察微血管结构形态,采用伊文思蓝实验观察血脑屏障通透性,通过透射电镜观察血脑屏障紧密连接超微结构,经western-blot、免疫组化法,检测缺血半球脑组织中与血脑屏障相关抗体（HIF-1α、MMP-9、occludin,ZO-1,和claudin-5）的表达情况,从血脑屏障的干预作用角度揭示清开灵有效成分抗脑缺血的作用机制。结果神经功能评分:假手术组无神经功能损伤行为,在脑缺血再灌注（I/R）24小时后进行神经功能缺损评分在。结果显示,与假手术组（Sham组）相比,模型缺血组（Ischemia组）的评分在24小时显着增加。然而,在用清开灵（QKL）或依达拉奉（EDA）处理后,QKL组和EDA组中的小鼠具有显着低于缺血组小鼠的评分（P<0.001）。这些结果表明,QKL以指示脑梗塞体积减少的方式改善神经功能缺损。TTC染色:通过TTC染色Sham组呈现出分布均匀的红色,而Ischemia组则出现了显著的缺血灶。与Ischemia相比较,I/R 24小时后,经QKL处理的小鼠能明显的减少脑梗死体积且与EDA具有相同的功效（P<0.001）。血脑屏障作为神经血管单元的一部分,故接下来的实验主要研究QKL对大脑神经元细胞和神经胶质细胞的的保护作用。HE染色:Sham组脑组织无明显病理改变,细胞形态正常神,经元细胞及神经胶质细胞排列整齐有序,胞核大,染色质排布均匀,核仁清晰;Ischemia组见大片梗死区,为液化性的坏死（软化灶）,神经细胞大片消失,坏死区内可见多量胶质细胞增生;坏死边缘（半暗带）较窄,可见多量中粒细胞浸润。神经细胞,固缩成三角形,胞核染色较深;QKL组和EDA组神经元数目轻度减少,呈轻度变性,红色神经元较多,小胶质细胞增生不明显。尼氏染色:Sham组神经胶质细胞排列整齐有序,未见水肿,清晰可见胞体、核仁,尼氏小体多见。Ischemia组尼氏小体明显减少,其中部分神经细胞核出现固缩深染。给药QKL和EDA干预后,可见梗死面积减少,结构完整的神经元数量较多,变性坏死的范围相对较小。统计结果显示,EDA和QKL组中Nissl染色的凋亡神经元细胞的数量显着低于Ischemia组（P<0.001）。缺血侧大脑皮层微血管结构的观察:在这里我们显示脑缺血后血脑屏障功能障碍中微血管结构的破坏。Sham组显示血管通畅,而Ischemia组显示节点样收缩变形。QKL和EDA组显着减轻脑缺血后的脑血管系统,脑缺血24小时后较4小时血管形态变化更严重。血脑屏障通透性变化:我们的定量结果显示,脑缺血再灌注24小时后,与Sham组相比,Ischemia的EB含量显着增加,表明脑缺血再灌注后BBB的通透性增加。然而,在24小时用QKL或EDA处理后,与Ischemia组相比,同侧半球的小鼠EB含量显着降低。这种方法产生的结果表明QKL可以减弱BBB的破坏和对脑缺血再灌注小鼠的BBB具有保护作用。血脑屏障紧密连接超微结构改变:使用透射电子显微镜将来自每个处理组的三只小鼠随机分配用于紧密连接的超微结构观察研究。Sham组的两个相邻内皮细胞之间的紧密连接表现为单独的细胞膜的典型增厚的暗线,代表连接蛋白的正常表达。相比之下,Ischemia组小鼠的紧密连接明显受损,连接蛋白层更薄。内皮细胞也变得水肿,并显示细胞质空泡化和线粒体变性。QKL组和EDA组的紧密连接异常超微结构明显减弱,表明QKL/EDA处理减弱了脑缺血再灌注引起的紧密连接损伤血脑屏障相关抗体的表达:本研究在I/R模型中,通过Western-Blot和免疫组化的检测方法证明了I/R能够诱发HIF-1α,激活HIF-1α/MMP-9通路,一方面脑缺血再灌注后高表达的HIF-1α可以促进MMP-9的表达升高,另一方面,高表达的MMP-9可以促进紧密连接蛋白occludin,ZO-1,和claudin-5降解。QKL和阳性药EDA干预后可以减少HIF-1α和MMP-9的表达,增加occludin,ZO-1,和claudin-5的表达,促进血脑屏障结构和功能的恢复,减轻血脑屏障的破坏。结论1.清开灵能缩小MCAO小鼠的脑梗死体积,提高神经功能评分,改善脑组织的病理损害,提示清开灵对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。2.小鼠脑缺血再灌注损伤24小时后,清开灵干预后减轻了脑缺血后微血管形态的改变和血脑屏障的通透性,且对紧密连接的超微结构有改善作用,表明清开灵可以减轻血脑屏障的破坏,对血脑屏障有保护作用。3.小鼠脑缺血再灌注损伤24小时后,HIF-1α的表达显著增加,激活了HIF-1α/MMP-9通路。给药干预后可以减少HIF-1α和MMP-9的表达,增加了紧密连接蛋白occludin,ZO-1,和claudin-5的表达,提示清开灵促进血脑屏障结构和功能的恢复。