炭疽是一种烈性的人畜共患传染病,其病原体是炭疽芽胞杆菌。炭疽芽胞杆菌形成的芽胞对环境抵抗力强并且容易制备,是一种潜在的生物战剂和生物恐怖剂。炭疽芽胞杆菌的毒力因子主要包括细菌荚膜和外毒素,荚膜能够帮助炭疽杆菌逃避宿主免疫系统攻击从而促进细菌在体内的大量繁殖;外毒素由保护性抗原(PA)、致死因子(LF)和水肿因子(EF)三种蛋白质成分组成,是导致宿主死亡的主要原因。PA通过与靶细胞表面的受体(CMG2或TEM8)结合后,介导LF和EF进入细胞发挥毒性作用。目前临床上对于炭疽的治疗主要使用抗生素,但抗生素仅能杀灭炭疽杆菌,无法抑制炭疽毒素的作用,因此对感染晚期及重症患者疗效不佳,发展针对炭疽毒素的特异性药物十分必要。目前针对炭疽毒素的药物研究主要包括单克隆抗体、特异性免疫球蛋白、小分子抑制剂等。我们的前期研究及其他实验室的报道均显示重组表达的可溶性炭疽毒素受体片段(称为“类受体”)可与细胞表面的受体竞争结合炭疽毒素,从而阻断毒素进入细胞,是一类新型的炭疽毒素抑制剂。本研究对实验室前期获得的类受体分子进行了优化设计和药效评价,主要内容包括通过与抗体Ig G Fc段或人血清白蛋白(HSA)融合等方式,延长类受体分子的体内半衰期;通过对影响与PA亲和力的关键氨基酸位点的组合突变来提高类受体分子与PA的亲和力;利用细胞模型和动物模型对候选分子进行药效评价和分析比较,从而确定类受体候选药物分子结构,为研制开发新型抗炭疽药物打下基础。CMG2是炭疽感染过程中的主要细胞受体,研究显示s CMG2(可溶性CMG2片段)与PA的亲和力较高,并且在体内外实验中显示出良好的抗炭疽毒素活性。但是s CMG2血浆半衰期短,影响了其成药性。融合抗体Ig G Fc段是延长蛋白药物体内半衰期的常用方法,本研究首先构建了s CMG2与人Ig G1 Fc融合的表达质粒,通过瞬时转染293F细胞,经过Protein G柱纯化获得融合蛋白(CMG2-Fc)。通过对炭疽毒素敏感的J774A.1细胞模型,对CMG2-Fc及s CMG2的生物学活性进行了比较分析,二者的毒素中和活性IC50分别为1.45 n M(CMG2-Fc)和2.03 n M(s CMG2),表明融合Fc后s CMG2活性没有受到影响。通过尾静脉将CMG2-Fc注射入SD大鼠体内,采用ELISA方法检测不同时间点血浆中CMG2-Fc含量,推算CMG2-Fc的体内半衰期为29.98 h,相较s CMG2延长了约60倍。在Fisher344大鼠模型上进行炭疽致死毒素(Le Tx,20μg rPA+10μg r LF)攻击的体内保护效果评价,比较了CMG2-Fc与sCMG2的毒素抑制活性,结果显示CMG2-Fc能够显著延长大鼠的存活时间,但不能保护大鼠存活,而s CMG2则可以完全保护大鼠。推测导致这种结果的原因可能是Fc自身的一些功能,如ADCC或CDC效应影响了CMG2-Fc在体内的活性,这仍须进一步的试验验证。上述结果表明,与Fc融合尽管显著提高了s CMG2半衰期,但体内毒素抑制活性下降,不是一种理想的类受体分子设计。与人血清白蛋白HSA融合是提高蛋白药物半衰期的另一种常用策略。本研究构建了s CMG2与HSA的融合蛋白(HSA-CMG2),通过3×G4S的linker将HSA和s CMG2连接,将基因片段插入酵母表达载体p MEX9K,电转毕赤酵母GS115,进行甲醇诱导分泌表达,通过Blue亲和层析、阴离子交换层析获得纯化蛋白。HSA-CMG2在大鼠体内的半衰期为5.01 h,相较s CMG2的体内半衰期延长了10倍以上。在J774A.1细胞模型上的毒素中和活性结果显示,HSA-CMG2的IC50为1.83 n M,与CMG2-Fc和s CMG2相近。在Fisher344大鼠模型上进行了体内保护效果评价,将HSA-CMG2与Le Tx预混合,再通过尾静脉注射入大鼠体内,结果显示与毒素摩尔比为2:1时,能够保护大鼠存活;在大鼠注射Le Tx前预防性给药,结果提前5分钟给药,HSA-CMG2和s CMG2组全部存活,如提前24 h给药,HSA-CMG2能够显著延长大鼠的存活时间,而s CMG2组存活时间与对照组(仅攻毒)无显著性差异。上述结果表明,s CMG2与HSA融合既延长了半衰期,又保持了较高的毒素抑制活性,是一个较理想的类受体药物候选分子。TEM8是另一种炭疽毒素受体,由于其与PA的亲和力较CMG2低10倍左右,因此s TEM8(可溶性TEM8片段)对炭疽毒素的抑制活性很低。实验室前期根据结构预测设计出s TEM8突变体L56A(本研究中称为MT2),与PA的亲和力显著提高。本研究在此基础上,通过联合突变多个影响s TEM8与PA亲和力的关键氨基酸位点,筛选到一个新的类受体分子MT4。利用E.coli表达系统,制备了出重组MT4。体外亲和力测定结果显示MT4与PA的亲和力为0.374 n M,高与s CMG2(1.01 n M)和MT2(0.52 n M)。细胞试验显示MT4与s CMG2的IC50接近(分别为2.59 n M和1.46 n M),好于MT2(4.45 n M),较s TEM8提高了近12倍(27.2 n M)。大鼠试验显示MT4和s CMG2在与Le Tx摩尔比为1:1时能够100%保护大鼠,而MT2的保护率为40%。以上结果表明,基于s TEM8的突变体分子MT4显著提高了与PA的亲和力,并且有与s CMG2相似的毒素抑制活性。MT4同样存在体内半衰期短的问题,本研究构建了MT4与Ig G1 Fc的融合蛋白(MT4-Fc)。但细胞试验发现MT4融合Fc后毒素抑制活性下降了约10倍。由于MT4-Fc和MT4分别由293F细胞和E.coli表达系统制备,推测MT4-Fc活性下降可能与细胞表达系统的糖基化修饰有关。将MT4上两个潜在N糖基化修饰位点突变后,E.coli表达的突变体MT4D与MT4的活性没有明显差异,而293F细胞表达的MT4D-Fc相较MT4-Fc毒素中和活性得到了部分恢复,因此在使用哺乳动物细胞表达s TEM8来源的类受体分子需要考虑糖基化修饰对类受体毒素中和活性的影响。本研究进一步参照HSA-CMG2的设计将MT4与HSA进行融合并在酵母系统中表达制备获得HSA-MT4。HSA-MT4在大鼠体内半衰期约为5 h,细胞试验显示HSA-MT4的毒素中和活性(IC50为2.95 n M)与MT4的相近,大鼠试验显示HSA-MT4与Le Tx预混注射能够完全保护动物存活。上述结果表明HSAMT4也可以作为类受体药物的候选分子。综上所述,本研究构建并纯化获得新型抗炭疽类受体分子HSA-CMG2,延长了s CMG2的体内半衰期,在体内外试验中均具有很好的毒素抑制活性;设计了基于s TEM8的类受体分子MT4,与PA的亲和力高与s CMG2,毒素抑制活性与s CMG2相似,并通过与HSA融合获得HSA-MT4,延长了MT4的体内半衰期。HSA-CMG2与HSA-MT4均可以作为抗炭疽类受体药物的候选分子,为研发具有自主知识产权的新型特异性炭疽治疗药物打下基础。