目的沙门菌（Salmonella）是一类严重危害人畜安全的病原微生物,也是用于研究病原感染与宿主免疫相互作用的典型模式菌,深入研究其致病机制对有效控制感染并形成防治新策略具有重要意义。感染的最终结局取决于宿主抵抗力和细菌毒力强弱的抗衡。铁是人类赖以生存最丰富的微量元素之一,亦是沙门菌生存、繁殖和致病的必需营养物质。宿主通过营养免疫防御机制,减少铁等微量元素的供应以降低病原微生物的生存能力和致病性,但如何调控以限制细菌从机体获取铁源仍不甚明了。沙门菌通过竞争宿主铁源以促进自身存活和逃避宿主清除,但对于其介导宿主铁代谢紊乱的关键分子,尤其是沙门菌毒力质粒编码的效应蛋白对宿主铁代谢的影响及机制仍亟待探索。本研究将从宿主营养免疫防御机制和沙门菌效应蛋白致病机制的双重角度,揭示沙门菌感染导致宿主铁代谢紊乱的原因,并通过特异性干预手段阐明关键调控分子和信号通路,在宿主与病原微生物互作和防控沙门菌等肠道致病菌感染领域寻求新的突破。方法第一部分模式识别受体NLRP6在沙门菌感染导致宿主铁代谢紊乱中的作用及机制1.1 NLRP6在沙门菌感染导致宿主铁代谢紊乱中的作用应用1 × 107 CFUs鼠伤寒沙门菌野生株SL1344,分别经口饲途径感染野生型（WT）小鼠和Nlrp6基因敲除（Nlrp6-/-）小鼠,记录小鼠生存率和体重;平板菌落计数法检测十二指肠、结肠、肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏等组织活菌数;HE染色评价上述脏器病理,探讨NLRP6在宿主抵抗感染中的作用。亚嗪铁微孔板法检测小鼠血清铁;普鲁士蓝染色观察脾脏铁负荷;亚嗪铁法检测小鼠十二指肠、结肠、肝脏和脾脏等组织、肝脏实质细胞和非实质细胞以及巨噬细胞的非血红素结合铁水平;荧光法测定原卟啉评价上述脏器和细胞的血红素结合铁量,探讨沙门菌感染时NLRP6对宿主铁代谢的影响。1.2 NLRP6对巨噬细胞铁代谢的影响及关键分子应用小鼠骨髓来源巨噬细胞建立沙门菌感染的体外细胞模型,平板菌落计数法比较铁螯合剂处理前后胞内活菌数;qPCR和WB检测铁摄取、储存和释放相关分子表达水平;亚嗪铁微孔板法检测胞内铁含量和细胞铁释放水平;使用针对铁释放执行蛋白Fpn的siRNA干预,比较处理前后胞内活菌数和铁含量,探讨NLRP6影响细胞铁代谢的关键环节,分析FPN在NLRP6影响细胞铁代谢中的作用。1.3 NLRP6影响FPN转录的关键信号通路应用上述巨噬细胞感染模型,使用转录抑制剂放线菌素D干预,qPCR 比较处理前后Fpn转录水平;使用Amt、Mtf1或Nrf2 siRNA干预,比较处理前后Fpn转录水平和胞内铁含量,分析NLRP6影响FPN表达的信号途径;qPCR和WB检测NRF2表达水平;qPCR检测NRF2通路下游靶基因Nqo1和和Hmox1转录,探讨沙门菌感染时NLRP6对NRF2信号通路的影响及其在下调FPN转录中的作用。1.4 NLRP6对巨噬细胞自噬的影响应用上述巨噬细胞感染模型,WB检测自噬标志物LC3表达;使用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1干预,WB比较处理前后LC3蛋白水平;使用质粒RFP-GFP-LC3与空载体或NLRP6表达载体共转染HeLa细胞,荧光显微镜观察RFP-LC3以及GFP-LC3点状聚集,分析NLRP6对巨噬细胞自噬的影响。1.5 NLRP6影响NRF2表达的关键调控分子和信号途径应用上述巨噬细胞感染模型,WB检测NDP52和p62等自噬受体的表达,以及p62在S351位点和mTOR下游靶分子4EBP1的磷酸化;使用mTOR特异性抑制剂雷帕霉素干预,WB 比较处理前后p62磷酸化水平;进一步通过WB检测mTOR上游关键分子AKT的磷酸化;使用AKT特异性抑制剂MK2206干预,WB 比较处理前后p62磷酸化水平;免疫共沉淀检测AKT与NLRP6互作,分析NLRP6对AKT的影响及机制,阐明NLRP6抑制NRF2激活的关键调控分子和信号通路。1.6 NLRP6影响KEAP1转录的关键调控分子和信号途径应用上述巨噬细胞感染模型,WB和qPCR检测NRF2负调控因子KEAP1的表达;WB检测KEAP1转录调控分子FOXO3A的磷酸化;使用AKT特异性抑制剂MK2206干预,WB 比较处理前后FOXO3A磷酸化水平;qPCR 比较处理前后KEAP1转录水平,探讨NLRP6在沙门菌感染时对KEAP1的影响及分子机制。1.7 NLRP6对肠上皮细胞铁代谢的影响及机制应用人结肠腺癌细胞Caco-2和NLRP6基因敲除Caco-2细胞建立沙门菌感染的体外细胞模型,亚嗪铁微孔板法检测胞内铁含量;qPCR和WB检测FPN表达水平;WB检测自噬受体蛋白和自噬标志物LC3表达水平、KEAP1和NRF2蛋白水平以及AKT的磷酸化水平;使用AKT特异性抑制剂MK2206干预,亚嗪铁微孔板法比较处理前后胞内铁含量,探讨NLRP6对肠上皮铁代谢的影响及分子机制。1.8 NRF2/FPN途径在NLRP6影响小鼠铁代谢中的作用应用上述小鼠感染模型,WB检测小鼠肝脏、脾脏和十二指肠FPN和NRF2表达水平;经尾静脉途径注射Nrf2shRNA,平板菌落计数法比较处理前后小鼠肝脏和脾脏沙门菌载量;亚嗪铁微孔板法比较处理前后小鼠肝脏、脾脏和肝脏巨噬细胞非血红素结合铁水平;WB检测小鼠肝脏巨噬细胞FPN表达,分析沙门菌感染时NRF2在NLRP6影响FPN表达导致小鼠铁代谢紊乱中的作用。1.9 AKT在NLRP6影响小鼠铁代谢中的作用应用上述小鼠感染模型,经口饲给予AKT特异性抑制剂MK2206,平板菌落计数法比较处理前后小鼠肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏活菌数;亚嗪铁微孔板法比较处理前后小鼠血清铁含量以及小鼠肝脏、脾脏和肝脏巨噬细胞非血红素结合铁水平;WB 比较处理前后小鼠肝脏巨噬细胞的FPN、NRF2和KEAP1表达水平以及AKT、4EBP1和FOXO3A磷酸化水平,分析沙门菌感染时AKT在NLRP6通过NRF2/FPN途径导致小鼠铁代谢紊乱中的作用。第二部分沙门菌效应蛋白SpvB对宿主铁代谢的影响及机制2.1沙门菌效应蛋白SpvB对宿主铁代谢的影响应用1 × 107 CFUs鼠伤寒沙门菌野生株SL1344和spvB突变株SL1344-⊿spvB,分别经口饲途径建立小鼠感染模型,平板菌落法检测肝脏活菌数;亚嗪铁微孔板法检测肝脏和血清铁含量;普鲁士蓝染色观察肝脏铁负荷;使用铁螯合剂地拉罗司,平板菌落法比较处理前后肝脏活菌数,分析铁在SpvB促进宿主菌繁殖中的作用。2.2沙门菌效应蛋白SpvB对宿主Hamp/FPN调节轴的影响应用上述小鼠感染模型,qPCR检测小鼠肝脏的系统铁代谢调控核心Hamp转录水平;WB检测小鼠肝脏FPN蛋白水平,探讨SpvB对Hamp/FPN调节轴的影响。应用WT、Hamp基因敲除纯合子和杂合子小鼠,分别经口饲途径感染1 × 107 CFUs鼠伤寒沙门菌SL1344或SL1344-⊿spvB建立小鼠感染模型,平板菌落法检测肝脏活菌数,分析Hamp/FPN调节轴在SpvB促进宿主菌繁殖中的作用。2.3沙门菌效应蛋白SpvB影响肝脏Hamp表达的关键信号通路应用上述小鼠感染模型,WB检测调控Hamp转录的关键分子SMAD1/5/9和STAT3在肝脏的磷酸化水平,探讨SpvB影响Hamp表达的机制。经腹腔给予STAT3抑制剂Stattic,平板菌落法比较处理前后肝脏活菌数;亚嗪铁微孔板法比较处理前后肝脏和血清铁含量;qPCR比较处理前后小鼠肝脏Hamp转录;WB 比较处理前后小鼠肝脏FPN表达,分析STAT3信号途径在SpvB上调Hamp转录中的作用。2.4沙门菌效应蛋白SpvB对肝脏炎症的影响应用上述小鼠感染模型,HE染色观察小鼠肝脏病理损伤;流式细胞术检测小鼠肝脏非实质细胞中骨髓来源细胞、巨噬细胞、Kupffer细胞和骨髓来源巨噬细胞所占比例,探讨SpvB对肝脏炎症细胞浸润和组织损伤的影响。2.5沙门菌效应蛋白SpvB对肝脏趋化因子和炎症因子的影响应用上述小鼠感染模型,qPCR检测小鼠肝脏炎症因子IL1β、TNFα和IL6以及趋化因子CCL2、CCL3和CXCL10的表达,WB检测小鼠肝脏IL6蛋白水平,探讨SpvB对肝脏趋化因子和炎症因子表达的影响。2.6沙门菌效应蛋白SpvB对肝脏炎症分子开关TREM-1的影响应用上述小鼠感染模型,qPCR和WB检测小鼠肝脏炎症分子开关TREM-1表达水平,探讨SpvB对TREM-1的影响;经腹腔注射给予TREM-1抑制剂LP17,平板菌落法比较处理前后肝脏活菌数;qPCR比较处理前后小鼠肝脏炎症因子和趋化因子表达水平,探讨TREM-1在SpvB影响肝脏炎症加重组织损伤中的作用。2.7 TREM-1在SpvB影响宿主系统铁代谢中的作用应用上述小鼠感染模型,经腹腔注射给予TREM-1抑制剂LP17,亚嗪铁微孔板法比较处理前后小鼠肝脏和血清铁含量;qPCR 比较处理前后小鼠肝脏Hamp表达水平;WB 比较处理前后小鼠肝脏FPN蛋白水平和STAT3磷酸化水平,探讨TREM-1在SpvB影响宿主系统铁代谢中的作用。2.8巨噬细胞/肝细胞互作在SpvB导致系统铁代谢紊乱中的作用应用人肝癌细胞HepG2分别与SL1344、SL1344-⊿spvB和spvB回补株SL1344-c-spvB共培养,qPCR检测HAMP转录水平;建立巨噬细胞/肝细胞（THP-1/HepG2）非接触式共培养模型并分别感染上述沙门菌,qPCR检测HepG2细胞HAMP转录;WB检测THP-1细胞FPN表达;使用HAMP siRNA转染HepG2细胞,WB检测THP-1细胞FPN表达;分别使用HAMP siRNA转染HepG2细胞、SpvB真核表达载体转染THP-1细胞和TREM-1 siRNA转染THP-1细胞,qPCR 比较处理前后HepG2细胞HAMP转录;比较处理前后THP-1细胞FPN表达和细胞铁负荷,分析巨噬细胞/肝细胞互作在SpvB影响系统铁代谢中的作用。结果第一部分模式识别受体NLRP6在沙门菌感染导致宿主铁代谢紊乱中的作用及机制1.1 NLRP6在沙门菌感染导致宿主铁代谢紊乱中的作用结果显示,Nlrp6-/-感染组小鼠生存率较高、体重下降较缓慢、各脏器沙门菌载量较低和病理损伤较轻,表明下调NLRP6表达有利于宿主抵抗沙门菌感染。发现Nlrp6-/-感染组小鼠血清铁含量较高、脾脏铁聚积较轻和肝脏游离铁水平较低;未见两感染组间小鼠十二指肠和结肠游离铁水平以及各脏器血红素结合铁含量有统计学差异;未见两感染组间小鼠肝脏实质细胞血红素结合铁含量和游离铁含量以及非实质细胞血红素结合铁含量有统计学差异,但Nlrp6-/-感染组小鼠肝脏非实质细胞和肝脏巨噬细胞游离铁水平均显著低于WT感染组小鼠,表明沙门菌感染时NLRP6影响宿主肝脏铁代谢,与肝脏非实质细胞中的巨噬细胞密切相关。1.2 NLRP6抑制FPN表达阻止细胞铁释放从而导致铁代谢紊乱结果显示,感染4h后Nlrp6--感染组的胞内活菌数显著低于WT感染组;使用铁螯合剂去铁酮后,未见两感染组间细菌载量有统计学差异,表明铁在NLRP6影响沙门菌胞内繁殖中发挥重要作用;发现Nlrp6-/-感染组铁释放分子FPN表达水平和铁释放量显著高于WT感染组,且胞内铁含量显著低于WT感染组;使用Fpn siRNA处理后,未见两感染组间胞内活菌数和铁含量有统计学差异,表明在沙门菌感染时下调NLRP6可促进FPN表达,使细胞铁负荷降低从而限制细菌繁殖。1.3 NLRP6经NRF2信号通路途径下调FPN转录结果显示,使用转录抑制剂放线菌素D后,未见两感染组间Fpn转录水平有统计学差异;转染Arnt siRNA或Mtf1 siRNA后,Nlrp6-/-感染组Fpn转录水平仍高于WT感染组,但转染Nrf2 siRNA后,未见两感染组间Fpn转录水平和胞内铁含量有统计学差异;发现Nlrp6--感染组NRF2蛋白水平较高,且NRF2下游靶基因Nqo1和Hmox1转录水平高于WT感染组,表明在沙门菌感染时下调NLRP6表达可激活NRF2通路从而上调FPN转录。1.4 NLRP6对巨噬细胞自噬的影响结果显示,Nlrp6-/-感染组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值较低,且使用自噬抑制剂巴佛洛霉素A1后仍低于WT感染组;过表达NLRP6的感染组RFP-LC3和GFP-LC3点状聚集数量均高于WT感染组,表明在沙门菌感染时NLRP6促进巨噬细胞自噬。1.5 NLRP6经AKT/mTOR途径抑制p62磷酸化介导的NRF2激活结果显示,未见两感染组间自噬受体NBR1、TAX1BP1和OPTN表达有统计学差异,但Nlrp6-/-感染组自噬受体p62和NDP52表达水平显著高于WT感染组;Nlrp6-/-感染组p62和4EBP1磷酸化水平显著高于WT感染组;使用mTOR抑制剂雷帕霉素后,未见两感染组间p62磷酸化水平有统计学差异;Nlrp6--感染组AKT磷酸化水平显著高于WT感染组;使用AKT抑制剂MK2206后,未见两感染组间p62和4EBP1磷酸化水平有统计学差异;免疫共沉淀结果显示NLRP6与AKT结合。综上表明,NLRP6结合并抑制AKT磷酸化激活,经AKT/mTOR信号途径下调p62磷酸化从而降低NRF2激活水平。1.6 NLRP6 经 AKT/FOXO3A 途径上调 KEAP1 转录结果显示,Nlrp6-/-感染组KEAP1表达显著低于WT感染组,且FOXO3A磷酸化水平显著高于WT感染组;经AKT抑制剂MK2206处理后,未见两感染组间FOXO3A磷酸化水平和KEAP1转录水平有统计学差异,表明在沙门菌感染时NLRP6通过抑制AKT/FOXO3A信号途径从而促进KEAP1转录。1.7 NLRP6通过NRF2/FPN途径导致肠上皮细胞铁代谢紊乱结果显示,NLRP6-/-感染组胞内铁含量较低且FPN表达水平较高;NLRP6--感染组NRF2蛋白水平较高且KEAP1表达水平较低;NLRP6--感染组AKT磷酸化水平显著高于WT感染组;使用AKT抑制剂MK2206后,未见两感染组间胞内铁含量有统计学差异;未见两感染组间NBR1、TAX1BP1和OPTN表达有统计学差异,但NLRP6-/-感染组p62和NDP52表达较高且LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ 比值较低。综上表明,在沙门菌感染时NLRP6经NRF2/FPN途径导致肠上皮细胞铁代谢紊乱。1.8 NLRP6通过NRF2/FPN途径导致小鼠铁代谢紊乱结果显示,Nlrp6-/-感染组小鼠肝脏、脾脏和十二指肠的FPN和NRF2表达水平高于WT感染组小鼠;使用Nrf2 shRNA后,未见两感染组间肝脏和脾脏活菌数、肝脏、脾脏和肝脏巨噬细胞非血红素结合铁水平以及肝脏巨噬细胞FPN蛋白水平有统计学差异,表明NLRP6经NRF2/FPN途径导致小鼠铁代谢紊乱。1.9 NLRP6影响AKT激活导致小鼠铁代谢紊乱结果显示,使用AKT抑制剂MK2206处理后,未见两感染组间小鼠肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏活菌数有统计学差异;未见两感染组间血清铁含量、肝脏、脾脏和肝脏巨噬细胞的非血红素结合铁水平有统计学差异;未见两感染组间肝脏巨噬细胞FPN、NRF2和KEAP1表达以及AKT、4EBP1和FOXO3A磷酸化有统计学差异,表明下调NLRP6表达可促进AKT磷酸化激活,经NRF2信号通路上调FPN表达降低小鼠铁负荷,有利于宿主维持铁稳态和限制沙门菌繁殖。第二部分沙门菌效应蛋白SpvB对宿主铁代谢的影响及机制2.1沙门菌效应蛋白SpvB对宿主铁代谢的影响结果显示,感染1 d后野生株感染组和spvB突变株感染组小鼠肝脏活菌数、肝脏铁负荷和血清铁含量均未见统计学差异;感染3 d后野生株感染组的肝脏沙门菌载量和肝脏铁含量较高,而血清铁含量显著低于spvB突变株感染组;使用铁螯合剂地拉罗司处理后,两感染组间小鼠肝脏活菌数未见统计学差异,表明SpvB与宿主铁代谢紊乱相关,可通过影响宿主系统铁代谢促进沙门菌繁殖。2.2沙门菌效应蛋白SpvB对宿主Hamp/FPN调节轴的影响结果显示,感染1 d后两感染组间小鼠肝脏Hamp表达未见统计学差异;感染3 d后野生株感染组Hamp转录水平显著高于spvB突变株感染组,FPN蛋白水平显著低于spvB突变株感染组;未见Hamp-/-小鼠两感染组间肝脏细菌载量有统计学差异,表明SpvB促进Hamp表达导致宿主系统铁代谢紊乱从而有利于沙门菌繁殖。2.3沙门菌效应蛋白SpvB激活STAT3通路上调肝脏Hamp表达结果显示,野生株感染组STAT3磷酸化水平显著高于spvB突变株感染组,但未见两感染组间SMAD1/5/9磷酸化水平有统计学差异;使用STAT3抑制剂Stattic处理后,两感染组间小鼠肝脏细菌载量、血清铁含量、肝脏铁负荷以及Hamp和FPN表达水平均未见统计学差异,表明SpvB经STAT3信号通路上调Hamp转录。2.4沙门菌效应蛋白SpvB促进肝脏炎症细胞浸润加重组织损伤结果显示,野生株感染组小鼠肝脏炎症细胞浸润较重,且非实质细胞中骨髓来源细胞、巨噬细胞和骨髓来源巨噬细胞所占比例均显著高于spvB突变株感染组,但未见两感染组间Kupffer细胞所占比例有统计学差异,提示SpvB经STAT3信号通路上调Hamp转录可能与肝脏炎症相关。2.5沙门菌效应蛋白SpvB促进肝脏趋化因子和炎症因子表达结果显示,感染1 d后野生株感染组小鼠肝脏趋化因子CCL2表达水平显著高于spvB突变株感染组,但未见两感染组间趋化因子CCL3和CXCL10以及炎症因子IL1β、TNFα和IL6表达水平有统计学差异;发现感染3 d后野生株感染组小鼠肝脏CCL2、CXCL10和IL6等炎症介质水平显著高于spvB突变株感染组,表明SpvB促进趋化因子和炎症因子表达,导致肝脏炎症细胞浸润和组织损伤加重。2.6沙门菌效应蛋白SpvB对肝脏炎症分子开关TREM-1的影响结果显示,野生株感染组TREM-1转录水平和蛋白水平均显著高于spvB突变株感染组;使用TREM-1抑制剂LP17处理后,两感染组间的小鼠肝脏细菌载量、CCL2、CCL3和CXCL10等趋化因子以及IL1β、TNFα和IL6等炎症因子的表达均未见统计学差异,表明SpvB促进TREM-1激活加重肝脏炎症。2.7抑制TREM-1激活可改善SpvB导致的宿主系统铁代谢紊乱结果显示,使用TREM-1抑制剂LP17处理后,野生株感染组与spvB突变株感染组间小鼠血清铁含量以及肝脏的铁负荷、Hamp转录水平、FPN蛋白水平和STAT3磷酸化水平均未见统计学差异,表明SpvB通过激活TREM-1促进肝脏炎症,经STAT3信号通路上调Hamp转录。2.8巨噬细胞/肝细胞互作在SpvB导致系统铁代谢紊乱中的作用结果显示,在HepG2细胞感染模型中未见SpvB影响HAMP转录;在巨噬细胞/肝细胞共培养模型中,携带spvB的感染组HepG2细胞HAMP转录水平较高且THP-1细胞FPN表达水平较低;使用HAMP siRNA或TREM-1 siRNA后,各感染组间HepG2细胞HAMP转录水平、THP-1细胞FPN表达水平和铁负荷均未见统计学差异;THP-1细胞转染SpvB真核表达载体后胞内铁含量显著升高,且HepG2细胞转染HAMP siRNA后可显著改善SpvB导致的THP-1细胞铁聚积,表明SpvB通过激活巨噬细胞TREM-1促进炎症因子释放从而上调肝细胞Hamp转录。结论1.宿主胞内模式识别受体NLRP6与AKT结合并抑制其磷酸化激活,一方面经由mTOR途径下调p62磷酸化减少NRF2表达,另一方面介导FOX03A磷酸化水平降低促进KEAP1转录,从而抑制KEAP1/NRF2信号通路激活下调FPN转录,导致宿主铁代谢紊乱从而有利于沙门菌繁殖和致病。2.沙门菌入侵宿主巨噬细胞后通过释放效应蛋白SpvB激活炎症分子开关TREM-1,促进IL6等炎症因子和CCL2等趋化因子释放,经STAT3依赖途径上调肝细胞Hamp转录,导致宿主系统铁代谢紊乱从而有利于沙门菌繁殖和致病。