目的:糖尿病性视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)现在已成为全世界成年人人群中的主要致盲眼病,其发病率逐年增加。以视网膜异常新生血管为特征的增殖性糖尿病视网膜病变(proliferative diabetic retinopathy,PDR)是导致糖尿病性视网膜病变患者视力丧失的主要原因之一。约1/3的糖尿病患者最终会发展为PDR期。目前有众多临床和实验研究表明,高血糖在PDR的发生和发展中起到了关键作用。高血糖可以引起视网膜内多种损伤,如蛋白激酶C、多元醇途径、己糖胺生物合成途径的异常激活,以及过度产生糖基化终末产物等,这些高血糖诱导的损伤还可以导致过度的氧化应激反应,从而进一步损害视网膜组织。同时,目前也有研究表明高血糖本身就具有促进视网膜异常新生血管的功能。目前研究认为,玻璃体内血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)含量增高是PDR视网膜新生血管形成的关键。VEGF可诱导视网膜血管内皮细胞增殖、迁移、血管管腔形成并导致异常新生血管的产生。异常的新生血管会引起玻璃体积血、牵拉性视网膜脱离、新生血管性青光眼等并发症,最终造成患者视力损害。目前有多种抗VEGF类药物应用于治疗DR,这些药物包括:贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普、康柏西普等。然而长期眼内注射抗VEGF药物会增加眼部并发症的风险,并且目前有研究表明在糖尿病患者人群中,长期眼内注射抗VEGF药物造成的全身并发症较其它人群明显增高,这些全身并发症包括高血压、血栓形成以及伤口延迟愈合等。这是因为糖尿病患者在眼内VEGF含量及新生血管活动增多的同时,体内其它组织如心脏和足等组织VEGF含量和新生血管活动降低。因此进一步研究DR引起新生血管的机制以及开发新的药物靶点是当务之急。哺乳动物体内细胞的氧化还原主要由谷胱甘肽(glutathione(GSH))和硫氧还蛋白(thioredoxin,TRX)这两个系统来调控。硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)又称维生素D3上调蛋白1(vitamin D3-upregulated protein 1,VDUP-1)是TRX系统中的内源性抑制蛋白。已有研究表明高糖刺激能引起多种视网膜细胞尤其是视网膜血管内皮细胞高表达TXNIP,而高表达的TXNIP在调节视网膜的炎症反应及氧化应激方面有重要的作用。同时,最新的研究表明,TXNIP与血管内皮细胞新生血管活动有着紧密联系,TXNIP通过与Rab5形成复合物,参与到VEGF-VEGFR2信号通路及其下游的PLC-γ通路,从而调节VEGF介导的内皮细胞新生血管功能。也有研究显示TXNIP基因敲除小鼠的VEGFR2/Akt通路功能及新生血管功能受损,当过表达TXNIP后其新生血管能力得到了恢复。然而TXNIP在PDR中所起到的作用目前尚无研究。本研究目的在于阐明高糖引起的人视网膜微血管内皮细胞(Human retinal microvascular endothelial cells,HRMECs)高表达TXNIP在高糖引起的细胞新生血管活动中所起到的作用及机制,以及敲除HRMECs的TXNIP基因对于高糖及VEGF所引起的新生血管活动的影响。同时我们通过视网膜新生血管体外培养模型,研究TXNIP基因敲除对于小鼠视网膜新生血管能力的影响。为进一步阐明TXNIP在PDR中所起到的作用及机制提供理论依据。方法:1高糖对HRMECs增殖、迁移、管腔形成的影响。HRMECs在37℃,5%CO2的条件下,以含有5%胎牛血清,1%内皮细胞生长补充剂(ECGS),100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的ECM培养基中培养。(1)CCK-8实验测定高糖对HRMECs增殖的影响:用正常浓度糖(Control,5.6m M),中度高糖(MHG,15m M)和高糖(HG,30m M)刺激HRMECs细胞。孵育24小时后,向每个孔中加入10μl CCK-8,然后再孵育2小时。当从红色变为黄色时,用分光光度计在450nm波长下测定各组的光密度(OD)值。(2)细胞划痕实验评估高糖对HRMECs迁移的影响:将HRMECs置于24孔板上并培养至90%细胞密度。在无血清培养基中孵育6小时后,用1ml黄色移液管尖端刮除单层细胞。随后,用PBS洗涤细胞三次以去除浮游细胞,并给予不同的刺激。在0小时和18小时拍摄细胞图像,分析平均细胞移动距离。(3)Transwell迁移实验测定高糖对HRMEC迁移的影响:在5%CO 2培养箱中将HRMECs在各种不同条件下培养24小时。然后,将细胞以1×10 5个细胞/孔的密度接种在含有200μl无血清培养基的Transwell小室中。同时将600μl的不同糖浓度的培养基加入到Transwell小室下方孵育6小时。6小时后,将Transwell在4%多聚甲醛中固定并用结晶紫染色。用棉签刮取Transwell的上表面以除去未迁移的细胞。对Transwell进行拍照,通过随机计数5个显微镜视野来确定迁移的细胞数。(4)Matrigel管腔形成实验测定高糖对HRMECs管腔形成的影响:将不同浓度糖培养基预处理的HRMECs(每孔5×10 4个细胞)接种在Matrigel的表面上,再培养6小时。培养结束时拍摄细胞图像,并使用Image-Pro Plus 6.0软件评估每个视野的总管腔形成长度。(5)中度高糖对HRMECs VEGF分泌的影响:通过使用ELISA试剂盒评估来自不同组HRMECs细胞的上清液中的VEGF浓度。(7)中度高糖对HRMECs的Akt/m TOR通路影响:使用蛋白免疫印迹法检测中度高糖条件下HRMEC中Akt和m TOR的表达。2 TXNIP在中度高糖促进的HRMECs迁移和管腔形成中的作用(1)中度高糖对HRMECs的TXNIP变化的影响:中度高糖刺激HRMECs,并在不同点收取细胞,通过蛋白免疫印迹法检测细胞TXNIP的变化。(2)中度高糖对HRMECs细胞内ROS的影响:HRMECs细胞内ROS水平的检测采用2’,7’-DCFH-DA探针法,将HRMECs均匀接种于6孔板中,细胞汇合度达到80%密度时更换无血清ECM培养基同步,6 h后按实验分组加入不同刺激物干预,后换成含2’,7’-DCFH-DA探针(终浓度为10μmol/L)的无血清ECM培养基,37°C下避光孵育30 min,PBS洗涤3遍,将未结合的2’,7’-DCFH-DA充分冲洗掉,流式细胞仪检测荧光强度,用荧光强度反应细胞内ROS含量。(3)检测TXNIP对中度高糖诱导的HRMECs新生血管形成的影响:细胞随机分为正常糖对照组(5.5mmol/L glucose,Control)、中度高糖(15 mmol/L glucose,MHG)、载体对照组(Scr si RNA转染,Scr si RNA)、中度高糖+载体对照组(Scr si RNA+15 mmol/L glucose,Scr si RNA+MHG)、TXNIP si RNA转染组(TXNIP si RNA单纯转染,TXNIP si RNA)、中度高糖+TXNIP si RNA转染组(TXNIP si RNA+15 mmol/L glucose,TXNIP si RNA+MHG)、中度高糖+抗氧化剂NAC组(NAC+15 mmol/L glucose,NAC+MHG)。分组刺激后进行细胞划痕实验,Transwell迁移实验,Matrigel管腔形成实验检测HRMECs新生血管形成情况。并用蛋白免疫印迹法检测敲除TXNIP基因对MHG诱导的HRMECs的Akt/m TOR信号通路的影响。3 TXNIP在VEGF促进的HRMECs迁移和管腔形成中的作用。检测TXNIP对重组人VEGF165(20 ng/ml)诱导的HRMECs新生血管形成的影响:细胞随机分为正常培养组(Control)、VEGF165刺激组(20 ng/ml VEGF165,VEGF)、载体对照组(Scr si RNA转染,Scr si RNA)、VEGF165+载体对照组(Scr si RNA+20 ng/ml VEGF165,Scr si RNA+VEGF)、TXNIP si RNA转染组(TXNIP si RNA单纯转染,TXNIP si RNA)、VEGF165+TXNIP si RNA转染组(TXNIP si RNA+20 ng/ml VEGF165,TXNIP si RNA+VEGF)、VEGF165+抗氧化剂NAC组(NAC+20ng/ml VEGF165,NAC+VEGF)。相应细胞分组进行CCK-8实验、细胞划痕实验、Transwell迁移实验、Matrigel管腔形成实验检测HRMECs的新生血管活动。Scr si RNA组和TXNIP si RNA组以VEGF165(20ng/ml)刺激5min,15min,30min,45min,1h,2h,4h后以蛋白印迹实验方法对各组细胞的VEGFR2、Akt及m TOR蛋白进行定量分析。4 TXNIP基因敲除对小鼠视网膜新生血管的影响。本研究以6周龄C57BL/6J背景的野生型小鼠(Wild type,WT)及相同背景的TXNIP基因敲除小鼠(TXNIP-/-)为动物模型;TXNIP基因敲除鼠模型的构建采用TALEN技术,用PCR实验检测其子代的基因表型。实验动物分为2组,野生型C57BL/6J小鼠组(WT)及TXNIP基因敲除小鼠组(TKO),每组小鼠各6只。小鼠处死后完整取出眼球,将其以无菌生理盐水充分冲洗。手术显微镜下以15°侧切刀沿角膜缘切开眼球,去除角膜、晶体和玻璃体,沿巩膜完整剥离神经视网膜组织,并去除视网膜粘附的脉络膜组织及视网膜色素上皮细胞。将提取的视网膜组织环形剪除约0.2mm宽周边视网膜组织,以视神经为中心,用小梁剪剪为均匀的4块视网膜组织。将视网膜组织放入预冷的无血清ECM培养基中2小时。来源于同一眼球的视网膜组织块分到不同的刺激组。将视网膜组织平铺在提前凝固的Matrigel基质胶上,神经纤维层面朝上,并使视网膜的边缘与基质胶充分接触。平铺好视网膜组织后在其上再加入液态的1:1培养基比例的基质胶300ml,室温放置1h固定。基质胶凝固后在每个孔内放入不同刺激的培养基500ml,分别为:Control组(无刺激物培养基);中度高糖组(15 mmol/L glucose,MHG);VEGF组(20ng/ml VEGF);中度高糖+VEGF组(15 mmol/L glucose+20ng/ml VEGF,MHG+VEGF)。每2天换一次培养基。实验第10天在倒置显微镜下观察视网膜新生血管长出情况并拍照。结果:1中度高糖通过激活HRMECs的Akt/m TOR通路诱导迁移和管腔形成,但不引起HRMECs增殖。1)HRMECs在不同浓度高糖培养24小时后,通过CCK-8实验方法检测其吸光度。结果表明无论是MHG组还是HG组细胞增殖较对照组无显著性差异(P>0.05)。2)通过细胞划痕实验和Transwell迁移实验方法研究不同浓度高糖对HRMECs迁移能力的影响,MHG组与对照组相比有显著性差异(P<0.01),而HG组与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。3)通过使用Matrigel管腔形成实验的方法研究不同浓度高糖对于HRMECs管腔形成的影响。MHG组HRMECs管腔总长度较对照组有明显的增加(P<0.05),HG组HRMECs管腔总长度较对照组无显著性差异(P>0.05)。4)收集在MHG刺激下不同时间点的细胞培养基上清液,并用ELISA试剂盒分析其VEGF含量。结果表明,HRMECs本身自分泌的VEGF量极少,并且MHG并不影响HRMECs自分泌VEGF含量的变化(P>0.05)。5)通过蛋白印迹实验方法检测Akt和m TOR的磷酸化变化,结果显示,MHG组Akt及其下游通路m TOR的磷酸化较对照组增加(P<0.05)2敲除HRMECs细胞的TXNIP抑制MHG引起的Akt/m TOR信号通路激活,进而降低MHG引起的迁移和管腔形成能力。1)通过蛋白印迹实验方法检测HRMECs在不同MHG刺激时间下的TXNIP变化。结果显示TXNIP在2h、4h、6h表达升高(P<0.05或P<0.01)。2)MHG刺激会短暂性的升高ROS,分别在5 min,30min,45min的时间点与对照组有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。而1h至24H其细胞内ROS较正常无显著性差异(P>0.05)。3)用TXNIP小干扰RNA(TXNIP si RNA)转染HRMECs,并用载体对照组小干扰RNA(Scrambled si RNA,Scr si RNA)作对照组,研究TXNIP基因敲除对HRMECs细胞新生血管活动的影响。细胞划痕实验及Transwell迁移实验及Matrigel管腔形成实验表明,TXNIP si RNA组在MHG刺激下的新生血管能力明显下降(P<0.01)。4)敲除TXNIP基因阻断了MHG对于HRMECs的Akt/m TOR信号通路的激活(P<0.01)。5)抗氧化剂NAC也可以降低MHG引起的迁移和管腔形成能力(P<0.01)。3敲除TXNIP基因阻碍VEGF诱导的VEGFR2信号通路激活,进而降低VEGFR2引起的HRMECs新生血管活动。1)HRMECs在VEGF下,其细胞增殖能力、迁移能力、管腔形成能力明显增加(P<0.01)。2)敲除TXNIP基因后降低了VEGF诱导的HRMECs新生血管活动(P<0.01)。3)敲除TXNIP基因降低了VEGF引起的HRMECs细胞的VEGFR2及其下游通路Akt/m TOR激活(P<0.01)。4)使用NAC后,VEGF诱导的HRMECs新生血管活动均有降低(P<0.01)。4 TXNIP基因敲除对体外培养的小鼠视网膜新生血管的影响1)在缺乏VEGF刺激的条件下,体外培养的视网膜生长出新生血管芽的能力非常低,VEGF+MHG组较VEGF组小鼠视网膜新生血管能力增强(P<0.05)。2)TKO小鼠视网膜新生血管能力明显降低(P<0.01)。3)TXNIP基因敲除对于小鼠玻璃体内VEGF含量无明细影响。结论:1中度高糖能引起HRMECs的迁移和管腔形成。这并不是由中度高糖刺激HRMECs自分泌产生更多的VEGF引起,而是通过激活Akt/m TOR通路引起的。同时中度高糖也能引起HRMECs细胞内ROS的短暂升高。2中度高糖能诱导HRMECs的TXNIP过表达,当敲除HRMECs的TXNIP后,中度高糖引起的HRMECs迁移和管腔形成能力将被抑制。同时其激活Akt/m TOR信号通路的能力也被抑制。抗氧化剂NAC也可以抑制中度高糖诱导的HRMECs迁移和管腔形成能力。3敲除HRMECs的TXNIP将会抑制VEGF诱导的新生血管活动,同时会抑制VEGF激活VEGFR2及其下游通路Akt/m TOR.4中度高糖+VEGF刺激比单纯使用VEGF刺激更能促进小鼠体外培养视网膜产生新生血管。TXNIP基因敲除小鼠的视网膜新生血管能力明显降低。但TXNIP基因敲除鼠的玻璃体内VEGF含量和WT小鼠没有明显差别。