近年来的大量实验证据表明,即使不受到射线的直接作用,那些与受辐射细胞相邻的细胞亦有可能受到损伤,产生辐射旁效应。但其分子机制尤其是辐射关键基因p53在辐射旁效应中的调控机制还不是很明确,因此本文主要研究p53及其下游相关分子在辐射旁效应中的作用及机制。肿瘤抑制基因p53在细胞由电离辐射引起的DNA损伤及死亡中起到至关重要的作用,同时也是在肿瘤中较常见的易发突变基因之一。本实验着重研究不同p53状态的肝癌细胞受到γ-射线辐射后对未受照射Chang氏肝细胞的旁效应,通过检测磷酸化P53蛋白表达情况、下游cyt-c释放情况、自由基分子变化情况以及它们之间的相互影响等,探讨p53与肝癌细胞辐射旁效应的关系。结果表明,仅野生型p53的HepG2肝癌细胞可引起旁细胞损伤,且具有明显的剂量效应和时间效应；而突变型p53的PLC/PRF/5肝癌细胞(PLC细胞)和p53缺失的Hep3B肝癌细胞几乎不能诱导辐射旁效应的产生。另外,p53抑制剂PFT-α及线粒体膜转换孔抑制剂(cyt-c抑制剂)CsA可显著抑制HepG2辐射旁效应的产生。事实上,这三株肝癌细胞的线粒体释放cyt-c都具有p53依赖性。外源性cyt-c可诱导PLC和Hep3B细胞产生辐射旁效应。进一步研究表明,自由基分子NO而并非ROS可作为cyt-c的下游分子参与了肝癌细胞辐射旁效应。iNOS抑制剂可以通过阻断NO的产生而抑制cyt-c/NO所介导的旁效应。这些结果说明,p53依赖的cyt-c释放在辐射诱导的旁效应中起到关键作用,而NO作为cyt-c的下游因子直接参与了辐射旁效应。电离辐射除了有着很强的杀伤肿瘤的治疗疗效外,还可能具有增强肿瘤的侵袭能力的副反应,受照射的肿瘤细胞很可能对周围隐蔽的未受照肿瘤细胞的侵袭能力产生一定的影响,从而导致肿瘤整体的进展。然而,p53作为辐射事件的关键基因,其对照射后肝癌细胞及附近肝癌细胞侵袭能力的影响及相关机制还鲜有报道。在本研究中,我们发现亚致死剂量照射可以增强人肝癌细胞HepG2的MMP-2和VEGF的分泌,及VEGFR2的表达,并介导了照射细胞侵袭能力的增强。采用VEGFR抑制剂SU1498及MMPs抑制剂GM6001处理HepG2细胞,发现照射引起的VEGF和MMP-2分泌及细胞侵袭能力增强均显著下降,证明辐射诱发的肿瘤细胞侵袭能力的增强与MMP-2、VEGF信号通路有关。同时,抑制或干扰照射细胞的p53可显著抑制MMP-2-VEGF通路的激活,并减弱辐射引起的细胞侵袭能力增强。此外,与受照射HepG2细胞共培养后,HepG2旁细胞的侵袭能力也显著升高,并且干扰照射细胞的p53可以显著减弱旁细胞的侵袭能力。这些结果说明,辐射诱导p53的上调可以激活VEGF-MMP-2肿瘤恶性转化通路,从而导致照射细胞及共培养旁细胞侵袭能力的增强。与低LET辐射相比,高LET重离子照射具有显著的生物学特异性,其中之一是重离子对受照射细胞凋亡的调控不依赖于细胞p53状态。本文采用p53状态不同的两株淋巴细胞,即野生型p53的TK6细胞及突变型p53的HMy2.CIR细胞(HMy细胞),研究其受到不同LET及不同射线种类照射后对未受照射HL-7702肝细胞的旁效应,并通过检测p53下游线粒体功能、磷酸化P66表达及ROS自由基变化情况及相互关系等,以阐明p53在不同辐射所介导的线粒体事件及旁效应中的作用。结果表明,TK6细胞受4 Gyγ-射线照射后,其线粒体发生功能障碍,磷酸化P66表达升高,ROS增多并能够介导对HL-7702细胞的辐射旁效应,但p53抑制剂PFT-μ可完全阻止上述分子事件及辐射旁效应的发生。由于p53的功能异常,HMy细胞受γ-射线照射后,其线粒体功能、磷酸化P66表达、ROS均没有变化,且不能诱导对HL-7702细胞的旁效应。采用重离子照射TK6和HMy细胞,无论两株细胞的p53状态如何,重离子均可显著引起两株细胞的线粒体功能障碍、磷酸化P66表达升高、ROS产生增高及诱导对HL-7702细胞的旁效应。尽管LET为30 keV/μm照射的碳离子照射下TK6细胞所介导的旁效应还具有p53半依赖性,但LET为70和180 keV/μm的碳离子照射下TK6所引起的上述分子变化及介导的旁效应不再受到p53的调控。此外,线粒体抑制剂Rotenone和Oligomycin、活性氧清除剂SOD可显著抑制重离子照射所引起的ROS生成及其所介导的对HL-7702细胞的旁效应。说明与低LET介导的旁效应依赖于p53不同,高LET重离子所介导的旁效应不依赖于p53,而与p53非依赖途径的线粒体活性氧产生密切相关。有关辐射旁效应的研究,人们的注意力集中在受照射细胞对附近非照射细胞的影响,但我们注意到,旁细胞通过反馈信号也可以保护受照射的细胞并减轻其辐射损伤,这种效应称为保护性旁效应。为了阐明细胞间的这种相互效应及其机制,我们研究了受α粒子照射的U937巨噬细胞与未受照射HL-7702肝细胞之间的相互影响。结果表明,共培养6h后,HL-7702细胞的线粒体膜电位显著下降,标志着旁细胞的细胞凋亡,同时受照射的U937细胞的微核形成率相比于无共培养组显著降低。经过共培养后,受照射U937细胞内的cAMP的上升、HL-7702旁细胞内cAMP下降。但当细胞膜信号被filipin阻断后,这两种细胞之间的cAMP通讯随之消失,它们之间的相互旁效应也不复存在。采用cAMP激活剂forskolin或cAMP抑制剂KH-7对细胞的处理,进一步证实：旁细胞释放的cAMP可以向受照射细胞转运,帮助受照射细胞减轻辐射损伤。但旁细胞本身因向靶细胞传递cAMP而引起自身cAMP缺乏将导致细胞凋亡。另外,报告基因实验结果显示,经过与照射的U937细胞共培养后,HL-7702旁细胞的p53基因被激活,而干扰HL-7702细胞的p53基因后,辐射旁效应也随之消失,此时,调控cAMP的药物forskolin和KH-7都失去对旁效应的调控作用。这些结果说明,cAMP可以通过细胞膜途径从HL-7702旁细胞转运至受α粒子照射的U937细胞,这种传递在辐射引起的双向性旁效应中扮演着十分重要的角色,而旁细胞cAMP所介导的旁效应是通过p53介导的促凋亡程序而产生的。我们的结果表明,低LET射线介导的旁效应是通过照射细胞的p53调控线粒体自由基的生成而引起的;高LET辐射介导的旁效应则不通过p53,而是直接激活线粒体从而诱导旁信号自由基的生成所引起的。同时,p53还作为转录因子,调控其下游具有细胞侵袭能力的分子,从而增强受照射细胞本身及共培养肿瘤细胞的侵袭能力；而且旁细胞的p53也参与了细胞对旁信号因子的应答从而介导了辐射旁效应的发生。