发状念珠藻（Nostoc flagelliforme）,俗称发菜,是一种陆生耐旱蓝藻,属于念珠藻属,主要分布于干旱和半干旱地区,具有极强的抗干旱能力。前期研究表明,在发菜生长和抗干旱过程中,分泌到胞外多糖胶鞘中的WSPA（acidic water stress protein）蛋白起着非常重要的作用。发菜中的WSPA蛋白作为一种新的β-半乳糖苷酶,参与发菜厚实胞外多糖胶鞘的动态调节,一方面,在水分充足时能够水解胞外多糖的糖苷键,使得多糖胶鞘变得疏松,有助于细胞吸水,促进细胞生长和藻丝延长;另一方面,干旱失水时能够将糖原单位添加到多糖链上,使得多糖胶鞘交联增厚,更具刚性,从而增强细胞的抗旱性。目前,发菜WSPA蛋白的酶学本质已清楚,但其蛋白结构及其其它的相关生化特性仍不清楚。在本研究中,以本实验室保存的液体培养发菜以及天然干燥发菜为材料,利用生物化学和分子生物学技术手段,对发菜WSPA蛋白进行生化特性及基因敲除功能的研究。主要研究结果如下:1.WSPA蛋白的活性区域分析。研究发现,WSPA蛋白在体外溶液中以二聚体的形式存在,且不受pH变化的影响。该蛋白β-半乳糖苷酶活性的中心活性区域为114个氨基酸的WSP-C4-m2区域,即全长基因中的第562个碱基到第902个碱基区域。此外,通过大量摸索发现WSPA蛋白在Index-E4这一Buffer条件下可以长出蛋白晶体,后续工作还有待深入。2.WSPA蛋白的比较理化特性研究。研究发现,发菜中具有β-半乳糖苷酶活性的WSPA蛋白,与本身存在的由lacZ基因编码的β-半乳糖苷酶（Nf-LacZ）发挥作用的最佳条件以及作用环境均不相同。WSPA蛋白发挥酶活的最佳pH为8.0,最佳温度为45℃,主要在胞外多糖胶鞘中发挥作用;Nf-LacZ蛋白发挥酶活的最佳pH为6.5,最佳温度为40℃,主要在胞内发挥作用。此外,两者在结构上也有不同,Nf-LacZ蛋白在体外溶液中与大肠杆菌中β-半乳糖苷酶一样以四聚体的形式存在,且受pH变化的影响。此外,分泌到胞外多糖胶鞘的WSPA蛋白作为胞外的主要成分之一,与其它胞外组分（Scytonemin、MAAs和多糖）均存在一定的相互作用。经研究发现,当一定浓度（2mg/ml-10mg/ml）的多糖存在时,WSPA蛋白的酶活性得到增强;相反,当一定浓度（5 μM-30 μM）的MAAs或Scytonemin存在时,WSPA蛋白的酶活性受到抑制。3.wspa基因的敲除。利用CRISPR/Cpf1基因编辑系统对发菜进行基因敲除,敲除发菜基因组中的两个wspa基因（COO9101770;COO9101773）,设计了两个PAM位点分别进行基因编辑,经PCR鉴定获得了一株敲除完全突变株,目前还有待进行生理表型的测定。