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本文从实验室保存的6株黑曲霉、1株米曲霉和采集的30多份土样出发,利用透明圈法,经过初筛、复筛得到一株产植酸酶的黑曲霉,并将其命名为黑曲霉QY。通过条件优化确定了制备黑曲霉QY原生质体的最佳条件:在液体培养条件下培养9h的菌丝;用蜗牛酶:纤维素酶=7:3的混合酶处理菌丝;在37℃酶解2.5h;酶液pH值为6;用0.7mol/L的氯化钠作为渗透压稳定剂。通过原生质体紫外诱变、化学诱变,得到了一株产植酸酶较高的菌株:黑曲霉QY-17,在30℃、220r/min条件下发酵培养3d,植酸酶发酵液的酶活力达到389.4U/mL,是原始菌株酶活的5.17倍。通过发酵培养基和发酵条件优化,得到黑曲霉QY-17最佳产酶培养基是以葡萄糖为碳源,其添加量为3g/100mL:玉米浆+NH4NO3为氮源,其添加量为1.5+0.25g/100mL;MgSO4·7H2O的最适添加量为0.07g/100ml。最佳产酶条件为:31℃、220r/min,250mL三角瓶装液量为40mL,接种量为10%,培养基起始pH6,发酵培养72h。在最适条件下培养黑曲霉QY-17,酶活可达到579.8U/mL,是初始产酶条件下的1.49倍,是原始出发菌株酶活的7.7倍。
考虑到植酸酶的应用,本文对黑曲霉QY-17植酸酶经7000r/min、20min离心的粗酶液的酶学性质进行了研究。发现37℃时黑曲霉QY-17植酸酶在pH2.5和pH5.5时都有酶活高峰。该植酸酶在pH2.8之间的稳定性很好,活性>70%,当pH>8时,酶迅速失活。这说明该酶在酸性和中性环境下稳定性比较好,在碱性环境中,容易失活。黑曲霉QY-17植酸酶最适反应温度为55℃,在37℃-60℃都具有较高的酶活性,超过60℃后酶活迅速下降。黑曲霉QY-17植酸酶具有较好的耐热性,在60℃保温10min后酶活保留在80%左右,在70℃保温10min后酶活仍能保留在60%左右。该酶对胃蛋白酶具有弱敏感性,在37℃、pH2.5下用1mg/mL胃蛋白酶处理植酸酶2h,植酸酶的酶活力仍能保留87.9%,说明黑曲霉QY-17对胃蛋白酶具有较强的抗性,这对于它们在单胃动物消化道内保持活性具有非常重要的意义。K+、Na+、Ca2+、Mg2+、Fe2+在高浓度时对黑曲霉QY-17植酸酶有抑制作用;Zn2+、Cu2+、Mn+在高浓度和低浓度下几乎没有什么抑制作用。黑曲霉QY-17植酸酶在pH2.5、37℃时对植酸钠的Km值为0.5mmol/L,Vmax为500nmol/mL·min;在pH2.5、55℃时对植酸钠的Km值为0.6mmol/L,Vmax为1000nmol/mL.min,这说明该植酸酶在pH2.5、37℃时对植酸钠有更大的亲和力。
对黑曲霉QY-17植酸酶进行了分离纯化,植酸酶发酵液经过7000r/min、20min离心、沉淀浓缩、DEAEFF离子交换柱、SuperdexTM75凝胶柱得到了植酸酶的两种同工酶:酶Ⅰ和酶Ⅱ,SDS-PAGE电泳呈单一条带,分子量分别为41kD和68kD,总回收率达到4.16%。