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柑橘果实无核是一个对于鲜食和加工都具有重要意义的优良经济性状。运用传统的育种手段进行果实品质改良由于受到柑橘复杂的生物学特性尤其是童期长的影响而进展缓慢。随着基因克隆技术和功能基因组学的发展,大量与种子发育相关的基因被克隆；同时柑橘类植物中短童期种质的发掘和转基因技术的应用为快速验证基因功能和进行柑橘果实品质改良提供了便利。本研究以早实枳的实生苗茎段为外植体,以根癌农杆菌介导法转入绿色荧光蛋白基因(GFP),建立了短童期种质-早实枳的转化再生体系；利用此体系转化拟南芥单性结实基因MAC12.2,并分析了转基因株系的花器官和果实性状,确定了MAC12.2基因在早实枳花和果实发育过程中的作用；同时将能导致种子败育的基因CG1-400-RNase转入默科特橘橙、桠柑、锦橙等特色多核柑橘品种,以期创造柑橘无核新种质。主要研究结果如下:
1.早实枳实生苗茎段遗传转化体系的建立。以早实枳实生苗茎段为外植体进行GFP基因的转化,不定芽再生率和转化率分别为91.8％和20.7％,共获得193个经GFP荧光检测和PCR检测均呈阳性的转基因株系；Southern blot结果表明15个转基因株系中GFP基因以1-3拷贝插入；Real-time RT-PCR结果表明不同转基因系GFP基因转录水平相对表达量的差异与转基因的拷贝数没有相关性；对移入温室18个月的25株转基因植株进行分析,17株开花,开花率68％；8株座果,座果率32％；GFP荧光检测表明,GFP可以持续稳定地在T0代花和果实以及T1代实生苗中稳定表达。
2.拟南芥单性结实基因MAC12.2功能验证。利用已建立的早实枳实生苗茎段转化体系进行MAC12.2基因的转化,不定芽再生率60.3％,共获得95个经GUS染色和PCR检测均呈阳性的转基因株系；Southern blot结果表明所检测的15个转基因株系中外源基因以1-4拷贝插入；对移入温室15个月的38株转基因植株进行分析,32株开花,开花率84.2％；11株座果,座果率28.9％；与对照相比,转基因株系中雌蕊败育花,尤其是畸形花数量明显增多,且转基因株系的花粉育性均有不同程度的降低；统计获得成熟果实的5个转基因株系的单果种子数,发现其单果种子数明显少于未转基因对照；Real-time RT-PCR结果表明MAC12.2基因在不同转基因株系的花器官中都有表达；以上结果初步表明,转MAC12.2基因早实枳异常花器官的产生和种子数量的减少与MAC12.2基因的表达与调控有一定关系。
3.MAC12.2基因转化锦橙胚性愈伤组织。获得MAC12.2基因的转化细胞系7个,再生芽经GUS染色、PCR分析鉴定为阳性,Southern blot结果表明所检测的3个转化株系中MAC12.2基因以单拷贝插入。
4.默科特橘橙成年态材料的灭菌及再生体系优化。不同消毒方法和不同消毒剂浓度对成年态材料的灭菌效果不同,其中以2.5％的次氯酸钠二次消毒法处理默科特橘橙成年态茎段综合效果最好；不同培养基对成年态茎段再生影响分析表明,不同配方对不定芽和不定根诱导能力不同,其中不定芽再生最佳配方为MT+2.0 mg/LBA+0.1 mg/L NAA,不定根再生最佳配方为1/2 MT+0.1 mg/L BA+0.5 g/L AC+0.25 mg/L NAA。
5.默科特橘橙上胚轴切段再生及遗传转化。1)激素BA对默科特橘橙上胚轴切段不定芽的诱导起决定作用,而一定浓度的IAA对不定芽的诱导起协同作用；当BA浓度为1.0 mg/L、IAA浓度为0.2 mg/L时,外植体再生的不定芽总数和‘壮芽数’均达到最多；同时不定芽再生不定根的最佳配方为1/2 MT+0.1 mg/L IBA+0.5g/L AC+0.5 mg/L NAA。2)利用已建立的默科特橘橙上胚轴切段的再生体系进行CG1-400-RNase基因的转化,转化率为0.93％,获得5株转化CG1-400-RNase基因的PCR阳性植株；转基因植株生长正常,与未转基因对照相比没有明显差异；其中3株经Southern blot分析表明,外源基因以双拷贝形式插入。
6.其它有核品种的上胚轴切段转化CG1-400-RNase基因。1)锦橙上胚轴切段的转化:转化率为3.94％,获得11株转化CG1-400-RNase基因的初次PCR检测阳性植株；11株转化植株经多次PCR分析,表明有8株扩增出目标条带；经Southernblot分析,外源基因以单拷贝形式插入,而多次PCR检测呈阴性的转基因株系J3和J9没有杂交信号,表明Southern blot是鉴定外源基因整合到植物基因组的最有效和最可靠的方法。2)红江橙和桃叶橙上胚轴切段的转化:转化率分别为1.38％和0.32％,分别获得3株红江橙和1株桃叶橙PCR检测阳性植株,表明相同柑橘种类中的不同基因型,其转化率也各不相同。
本文还对拟南芥MAC12.2基因在早实枳花器官和果实发育过程中的功能,短童期种质早实枳在柑橘基因功能验证和基因组学研究中的应用前景,提高农杆菌介导的柑橘遗传转化率的方法,以及柑橘无核育种的新策略进行了探讨。