论文部分内容阅读
目的：对人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源的基因（phosphatase andtensin homologue deleted chromatosome10，PTEN）低表达在肾透明细胞癌（clear-cellrenal-cell carcinoma，CCRCC）耐药性中所起的作用及其可能机制进行了探讨，以期为临床CCRCC的有效治疗提供新的有效靶位点。方法：采用免疫组化和免疫蛋白印迹的方法检测了抑癌基因PTEN在CCRCC中的表达情况；采用基因沉默的方法结合流式细胞分析或者CCK8分别研究了PTEN沉默对CCRCC细胞凋亡和细胞增殖能力的影响；采用基因沉默，免疫共沉淀结合免疫印迹的方法研究了PTEN对etoposide诱导的细胞凋亡的影响及其作用机制。结果：CCRCC中PTEN mRNA和蛋白表达显著降低。转染PTEN shRNA后CCRCC细胞系ACHN中PTEN mRNA和蛋白的表达被有效抑制，etoposide诱导的细胞凋亡明显减少，细胞增殖能力增强，说明PTEN抑制能够抵制凋亡，促进细胞增长。Etoposide诱导后，细胞内PTEN的表达量没有明显改变，说明etoposide对PTEN并没有直接的作用。Etoposide诱导引起p-Akt、p-HDM2、HDM2的表达量减少，而p53、PUMA和Cleaved PARP的表达量增加，提示etoposide通过抑制Akt信号通路，并可能通过p53依赖的细胞凋亡发挥作用；与之相反，PTEN沉默后，p-Akt、p-HDM2、HDM2的表达量增加，而p53、PUMA和Cleaved PARP的表达量减少，说明etoposide诱导的Akt信号通路抑制被PTEN抑制所解除，同时其诱导的p53依赖的凋亡受到抑制。Western blotting结果显示，在CCRCC组织中同样发现p-Akt、p-HDM2、HDM2的表达量增加，p53的表达量减少；组织免疫化学实验得出了同样的结果，进一步证实了体外实验的结果。细胞免疫共沉淀显示，etoposide诱导后， ACHN中与HDM2相互作用的p53的量减少，PTEN沉默后与HDM2相互作用的p53的量增加；CCRCC组织免疫共沉淀结果也显示，与正常肾脏组织相比，与HDM2相互作用的p53的量也明显增多。结合前面的实验结果说明，etoposide处理抑制了HDM2与p53的相互作用，阻滞了HDM2导致的p53降解，从而促进了p53依赖的细胞凋亡；而PTEN抑制则逆转了etoposide对HDM2与p53的相互作用的抑制，阻止了p53依赖的细胞凋亡。结论：CCRCC中Akt/HDM2信号通路被激活，同时p53的表达被抑制。PTEN的沉默引起etoposide诱导的细胞凋亡受到抑制，促进了细胞增殖。同时Akt/HDM2信号通路被激活，HDM2与p53之间的相互作用增强，引起p53的抑制。说明CCRCC中PTEN的表达降低引起Akt/HDM2信号通路的激活，阻滞了etoposide诱导的p53依赖的细胞凋亡，从而引起CCRCC对etoposide产生耐药性。