论文部分内容阅读
目的:以过表达钙蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin)的小鼠及血管平滑肌细胞(vascular smooth mucle cells,VSMCs)为研究对象,评估钙蛋白酶抑制蛋白/钙蛋白酶(Calpastatin/Calpain)系统在平滑肌细胞增殖、迁移、胶原合成及血管再狭窄中的作用,旨在探讨Calpastatin/Calpain系统在辛伐他汀(simvastatin)改善PDGF诱导的血管再狭窄过程中的作用。方法:整个实验分为动物实验及细胞实验两部分。第一部分:动物实验1、分组:C57BL/6J野生小鼠假手术组(WT mice)、C57BL/6J野生小鼠模型组(WT ligation mice)、Calpastatin转基因小鼠假手术组(TG mice)、Calpastatin转基因小鼠模型组(TG ligation mice)2、血管再狭窄造模采用结扎颈动脉分叉处的方法造模[1]。3、通过HE染色的方法检测造模后0天、7天、14天、21天、28天劲动脉的内膜增生及血管狭窄程度。4、采用qRT-PCR的方法检测劲动脉Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin mRNA的表达情况。5、造模后14天,采用免疫组织化学的方法检测增殖细胞核抗原(ProliferatingCellNuclearAntigen,PCNA)、Ⅰ型胶原纤维(CollagenⅠ)、Calpain-1、Calpain-2、Calpastatin、基质金属蛋白酶2(MMP2)、膜型基质金属蛋白酶1(MT1MMP)、基质金属蛋白酶抑制因子2(TIMP2)在增生血管中的分布及表达。第二部分:细胞实验1、分组:野生小鼠平滑肌细胞组(WT)、野生小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB组(WT+PDGF-BB)、野生小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB+辛伐他汀组(WT+PDGF-BB+Simvastatin)、转基因小鼠平滑肌细胞组(TG)、转基因小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB组(TG+PDGF-BB)、转基因小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB+辛伐他汀组(TG+PDGF-BB+Simvastatin)2、用CCK8试剂盒检测各组干预条件干预后血管平滑肌细胞的增殖能力。3、分别应用Transewell及细胞划痕实验检测各组干预条件干预后血管平滑肌细胞的定向与非定向迁移能力。4、采用qRT-PCR的方法检测各组干预条件干预后血管平滑肌细胞的Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin,MMP2,MT1MMP,TIMP2,CollagenⅠ,TGF-β1 mRNA的表达情况。5、用蛋白免疫印迹法(Western blotting)检测各组干预条件干预后血管平滑肌细胞相关蛋白(Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin,MMP2,MT1MMP,TIMP2,TGF-β1)的表达,通过检测SBDP(Spectrin breakdown products)的表达来检测Calpain的活性。结果:1、血管再狭窄后Calpain-1,Calpain-2的mRNA表达增加,Calpastatin的mRNA表达减少。2、造模14天后,与假手术组相比,Calpain-1,Calpain-2,TGF-β1的mRNA表达增多,而转基因小鼠组较野生小鼠组Calpain-1,TGF-β1的mRNA表达下降,Calpain-2的表达变化无统计学差异,且转基因小鼠组较野生小鼠组PCNA 阳性率减低,Collagen Ⅰ,Calpain-1,Calpain-2,Calpastatin,MMP2,MT1MMP/TIMP2的蛋白表达减少。3、野生小鼠平滑肌+PDGF-BB组较野生小鼠平滑肌细胞组细胞增殖、迁移增加,且 Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ,Calpain-1 的 mRNA 表达增多,Calpain-1,Calpain-2,MMP2,MT1MMP,TGF-β1 的蛋白表达增多,Calpain 的活性增加,而Calpastatin的蛋白表达减少。转基因小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB组(TG+PDGF-BB)较野生小鼠平滑肌+PDGF-BB组(WT+PDGF-BB)相应的都表达减少,Calpastatin的蛋白表达增加。4、野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀组(WT+PDGF-BB+Simvasta tin)较野生小鼠平滑肌+PDGF-BB 组(WT+PDGF-BB)Calpastatin 的 mRNA表达增加,而 Calpain-1,MMP2,TGF-β1,Collagen Ⅰ,Collagen Ⅲ 的 mRNA 表达减少,细胞增殖、迁移也减轻。转基因小鼠平滑肌细胞+PDGF-BB+辛伐他汀组(TG+PDGF-BB+Simvastatin)较野生小鼠平滑肌+PDGF-BB+辛伐他汀组(WT+PDGF-BB+Simvastatin)Calpain-1,MMP2,Collagen Ⅰ 的 mRNA表达及细胞增殖、迁移也减轻。结论:1、血管再狭窄的病理过程中,Calpain-1,Calpain-2表达增加,而Calpastatin表达减少。2、过表达Calpastatin可以使血管再狭窄减轻。3、Calpastatin/Calpain系统通过MT1MMP/TIMP2的比例来调节MMP2及其下游分子TGF-β1。4、过表达Calpastatin通过调节Calpain-1、Calpain-2、MMP2、TGF-β1的表达及Calpain的活性抑制PDGF诱导的平滑肌细胞增殖、迁移、胶原沉积。5、辛伐他汀改善PDGF诱导的血管再狭窄过程Calpastatin/Calpain系统是其中一条重要的通路。