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目的:载脂蛋白M(apoM)是由Xu和Dahlbaek于1999年发现并从乳糜微粒中分离和克隆,分子量为26KD。人类apo M基因定位于第6号染色体短臂,紧邻MHC-Ⅲ基因区。该蛋白属于疏水性分子结合蛋白家族(lipocalinfamily)成员,主要存在于人血浆高密度脂蛋白(HDL),少量存在于富甘油三酯脂蛋白(TRL)及低密度脂蛋白(LDL)中。最新的研究表明,载脂蛋白M可能对2型糖尿病大血管病变有保护作用,对抗动脉粥样硬化。2型糖尿病合并大血管病变病人IL-6比正常人明显增高,作为炎症反应的核心细胞因子,IL-6在2型糖尿病大血管并发症中的作用备受关注,鉴于此,本课题在体外研究IL-6对人肝母细胞瘤细胞(HepG2)apoM表达的影响,进而探索2型糖尿病合并大血管病变与apoM、IL-6相关的发病机制。
方法:
1.体外培养HepG2细胞,分别以不同浓度的IL-6(1.25,2.5,5,10,20,40,80ng/ml)干预细胞24小时,提取细胞总RNA,应用逆转录PCR、琼脂糖凝胶电泳、实时荧光定量PCR法检测mRNA水平的HepG2细胞载脂蛋白M的表达量,并同时检测另一种载脂蛋白apoAI的表达,用同样的干预方式,检测IL-1a对apoM表达的影响。用蛋白免疫印迹法(WB)检测分泌到培养基中的载脂蛋白M的表达量。
2.用浓度为2.5ng/ml的IL-6对HepG2细胞进行不同时间干预(0h、1h、3h、6h、12h、24h),应用逆转录PCR、琼脂糖凝胶电泳和实时荧光定量PCR方法检测apoM的表达,考察IL-6干预时间不同对apoM表达的影响。
结果:
1.IL-6(1.25,2.5,5,10,20,40,80ng/ml)对HepG2细胞apoM的表达具有抑制作用,与对照组0ng/ml比较差异有统计学意义。IL-6浓度从0上升到80ng/ml,apoM的相对表达水平逐渐降低,IL-6浓度0ng/ml组,1.25ng/ml组分别与其他各组比较差异均有统计学意义,且0ng/ml组、1.25ng/ml组、2.5ng/ml组之间呈现一定的剂量依赖性。但是不同浓度的IL-6(1.25,2.5,5,10,20,40,80ng/ml)对HepG2细胞干预,apoA1表达水平没有统计学差异,IL-1a(1.25,2.5,5,10,20,40,80ng/ml)对apoM表达的影响亦无统计学差异。
2.时间依赖实验结果显示,IL-6干预时间不同,其对HepG2细胞apoM的抑制程度有不同,IL-6干预HepG2细胞12h,和IL-6干预24h对apoM的抑制作用表现显著,且后者大于前者。而小于12h的干预,抑制作用不明显。
结论:IL-6能够抑制HepG2细胞载脂蛋白M的表达,这种抑制呈剂量依赖性,并且具有特异性和饱和性。IL-6抑制apoM的表达,apoM的表达降低削弱了apoM对动脉粥样硬化的保护作用,成为2型糖尿病患者合并大血管病变的又一发病机制。2型糖尿病合并大血管并发症的发病机制是非常复杂的,应为多种机制共同作用的结果,本实验利用体外细胞培养,检测了IL-6与apoM这两者之间的关系,将炎症因子与脂代谢联系在一起,为进一步明确2型糖尿病大血管并发症的发病机制打下基石。