论文部分内容阅读
随着经济的发展,人们对食品安全的关注度越来越高。副溶血弧菌作为最常见的食源性病原微生物,已经为大众所关注,然而目前的传统检测手段耗时且操作不方便,已不能够满足人们对食品安全高要求的标准。所以,我们迫切需研发出高效率且准确的检测手段,来监控食源性致病菌,以保证人类的健康。等温核酸扩增方法((Loop-mediated isothermal amplification,简称LAMP)是一种由日本科学家Notomi开发的新型核酸扩增技术。本文以副溶血弧菌作为研究对象,利用浊度仪和荧光染料,建立了LAMP快速检测方法,并应用于海产品的直接检测。主要研究内容和结果如下:(1)根据副溶血弧菌的不耐热溶血毒素基因(tlh),设计特异性等温核酸扩增的引物,建立新型等温核酸扩增方法,实现对副溶血弧菌的快速检测。结果表明:等温核酸扩增方法在65℃恒温条件下一个小时即可完成对副溶血弧菌的检测。利用实时浊度基因扩增仪LA-320C能够实时观测扩增的整个过程;通过添加荧光染料SYBR Green I,能够快速便捷的观察检测结果;另外本论文还研发了新的指示剂钙黄绿素来代替荧光染料SYBR Green I,阳性结果的荧光绿很明显区别于阴性结果淡橙色,同时使得整个基因的检测过程在密闭的环境中进行,免去了开盖加染料这一环节。(2)本课题建立了快速检测副溶血弧菌的LAMP法,并将其利用于实际海产品的检测中。灵敏度实验表明LAMP检测副溶血弧菌纯培养物的灵敏度为8CFU/反应,人工污染副溶血弧菌的牡蛎检出限为80CFU/反应。70种市场销售的海产品中,结合预增菌(3h)的LAMP方法,检测结果中有11份阳性样品,59份阴性样品,与国际的符合率为100%。研究表明,本研究建立的LAMP法检测海产品中的副溶血弧菌具有特异性强、灵敏度高、方便快捷、成本低等特点,为副溶血弧菌的检测提供了新的发展方向。