天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防线,也是激活适应性免疫的基础,在宿主清除病毒的免疫反应中具有关键作用,因此成为当前免疫学研究的热点。天然免疫应答就是病原微生物感染机体后,首先通过模式识别受体(pattern-recognition receptor, PRR)识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular pattern, PAMP),从而激活一系列信号通路,诱导包括IRF3和NF-κ B在内的转录因子的活化入核,协同促进Ⅰ型干扰素、炎症因子等多种细胞因子的表达和分泌。Ⅰ型干扰素通过与细胞膜上的干扰素受体相互作用,诱导一系列抗病毒蛋白的表达,这些抗病毒蛋白协同作用,通过抑制病毒复制或诱导被感染细胞的凋亡,实现细胞的抗病毒反应。炎症因子所引发的炎症反应能够激活天然免疫细胞,并诱导适应性免疫应答的启动。由此可见,Ⅰ型干扰素等细胞因子对机体的抗病毒免疫反应具有至关重要的作用。而在众多信号通路中以Toll样受体(Toll-like receptors, TLRs)和维甲酸诱导的基因Ⅰ样受体(Retinoic acid-induced gene I like receptors, RLRs)所介导的信号转导通路最为热点。E3泛素连接酶(E3ubiquitin ligase)是一种具有调节目的蛋白泛素化水平的分子,通常以K48偶联的泛索化方式促进目的蛋白通过蛋白酶体系统降解,或者通过K63偶联的泛素化促进目的蛋白的活化。目前已有报道显示E3可以通过调节TLR和RLR通路中的多个信号分子的降解或者活化从而调节并平衡免疫应答。如TRIM30a、TRIM21、Triad3A、A20、 RNF5、RNF125、AIP4以及PSMA等可通过K48泛素化形式降解相应接头蛋白,进而负向调节信号通路。关于E3连接酶如何参与到抗病毒的信号通路中已成为当今科学研究领域中的重要话题。一.研究目的：前期研究发现TRIP(TRAF-interacting Protein)在TNF-α介导的NF-κB信号转导途径中发挥着重要调节作用,并认为TRIP通过阻断TNFR与TRAF2的结合的方式负向调节信号通路：又有报道称TRIP具有体外泛素化功能,但关于其靶点却没有相关报道。因此TRIP是否参与到TLR和RLR所介导的I型干扰索的产生过程中,并且是否通过其泛素化功能起到相应作用都不得而知。二.研究方法：1.TLR信号通路对TRIP的调控1.1TLR对TRIP的表达影响用TLR4的配体LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞，在刺激的不同时间点收获RNA和蛋白，利用RT-PCR及Western Blotting方法,检测LPS刺激后TRIP在RNA水平和蛋白水平上的变化。1.2TRIP在细胞内的定位将TRIP构建到含FLAG标签和GFP标签的表达载体上,将表达载体转染HBK293,利用免疫荧光技术检测TRIP在细胞内的定位。1.3TLR对TRIP细胞内定位的影响用TLR4的配体LPS刺激巨噬细胞系RAW264.7,在不同时间点收获细胞。将细胞浆蛋白和细胞核蛋白分别提取，利用Western Blotting方法，检测LPS刺激后TRIP在细胞内的定位是否发生变化。2TRIP负向调控TLR及RLR介导的IFN-β的产生2.1TRIP对TLR3/4介导的IFN-β产生的的影响用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰,或者将TRIP超表达质料转染HEK293-TLR3细胞系,用TLR3的配体Poly (I:C)和TLR4的配体LPS分别刺激细胞，利用RT-PCR, I-LISA及报告基因方法检测IFN-β的mRNA(?)水平，分泌水平及报告基因活性水平的变化，探讨TRIP对介导的信号信号通路的影响。2.2TRIP对RIG-I介导的IFN-P产生的的影响用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰，或者TRIP超表达质粒转染HEK293细胞系,用Sev感染细胞系或者Poly (I:C)转染细胞系,活化RIG-I信号通路,分别用RT-PCR, ELISA和报告基因方法检测IFN-β的mRNA水平,分泌水平及报告基因活性水平的变化,探讨TRIP对RLR介导的信号信号通路的影响。3TRIP调控IFN-β表达的分子机制3.1TRIP对转录因子IRF3活性的影响将TRIP超表达质粒转染HEK293细胞系,再用Sev感染细胞系或者poly(I：C)转染细胞系,检测IRF3的磷酸化,二聚化以及报告基因活性的变化,探讨TRIP过表达后对RLR介导的IRF3活化的影响。用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰,用TLR3的配体Poly (I:C)和TLR4的配体LPS分别刺激,利用Western Blotting方法,检测TRIP干扰后对LPS及Poly (I:C)介导的IRF3活化的影响。3.2TRIP靶点的寻找将TLR,RLR信号通路中的TRIF,RIG-I,MDA5, MAVS,TBK1.IRF3等接头蛋白表达载体与TRIP过表达载体共转染HEK293,利用RT-PCR及报告基因技术检测TRIP对不同接头蛋白所介导的IFNβ m RNA表达及报告基因活性的影响。3.3TRIP对接头蛋白的降解筛选高表达TRIP的RAW264.7稳定细胞株或者用干扰RNA将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰,用LPS刺激细胞不同时间点,收获蛋白,用TRAF3, TRAF6, IRF3, STAT1等特异性抗体做VVestern Blotting,探究TRIP对各个接头蛋白内源性表达量的影响。将TLR,RLR信号通路中TRAF3,TBK1,IRF3等接头蛋白的表达载体与TRIP的表达载体共转染HEK293, Western Blotting的力’法探究TRIP对各个接头蛋白的表达量影响,并加入蛋白酶体抑制剂MG132,观察TRIP内降解作用是否消失。3.4TRIP对接头蛋白的泛素化将TRIP表达载体,接头蛋白表达载体与泛素表达载体一同转染HEK293,加入蛋白酶体抑制剂MG132,用接头蛋白抗体做免疫共沉淀,用泛素抗体进行Western Blotting,探讨TRIP是否对接头蛋白进行泛素化。将TRIP表达载体,接头蛋白表达载体与野生型泛素表达载体,K48位点突变泛素表达载体,K63位点突变泛素表达载体一同转染HEK293,用接头蛋白对应抗体做免疫共沉淀,用泛素标签抗体进行Western Blotting,探讨TRIP(?)时接头蛋白的泛素化形式。4TRIP抵抗病毒的生理意义4.1TRIP对病毒介导的IFN-β的影响将TRIP超表达质粒转染HEK293细胞系,用Sev感染细胞,使用RT-PCR, ELISA技术检测TRIP对IFN-β产生的影响；报告基因检测TRIP对IFN-β, IRF3活性的影响；Western Blotting检测TRIP对IRF3二聚化的影响,及对接头蛋白降解的影响。用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰,用Sev感染细胞，重复上面的实验,探究干扰TRIP后是否具有相反的作用4.2TRIP对病毒增殖复制影响将TRIP超农达质粒转染HEK293细胞系,24小时后转染Poly(I:C),静置培养6小时并加入VSV,第二天收集上清及细胞mRNA,利用病毒空斑实验及RT-PCR技术,检测病毒的数量。用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰，重复上面的实验，探究干扰TRIP后是否具有相反的作用。三.实验结果1. TLR信号通路对TRIP的调控1.1TLR促进TRIP的表达我们为探讨TRIP是否参与TLR信号通路中，首先用TLR4的配体LPS刺激小鼠腹腔原代巨噬细胞,通过RT-PCR及Western Blotting方法检测发现,从LPS刺激4小时开始，TRIP的表达量逐渐增加，在12到16小时时达到高峰LPS刺激24小时后TRIP的水平又有所恢复，用TLR3的配体Poly(I:C)(?)激或者RIG-(?)的配体Scv感染细胞后，TRIP的表达量也发生用样的变化。这说明TRIP有可能参与到TLR及RLR介导的信号转导中。1.2TRIP主要定位于细胞浆由于很多文献报道的TRIP的定位差距较大,有人认为TRIP分布在胞核,有人认为TRIP在胞质,TRIP的定位对于其之后的功能研究而言至关重要，因此我们通过免疫荧光的方法检测TRIP的细胞定位,用FLAG-TRIP转染HEK293,24小时后,进行免疫荧光实验,用抗FLAG的荧光二抗孵育细胞,在488nm波长激发光下观察,发现TRIP即分布在胞核又分布在胞浆,且在胞浆的量远远大于在胞核中的量,另外我们观察到一个有趣的现象,即TRIP在胞浆中成散点状分布,这与TBK1的分布极其相似,这也为之后的靶点寻找提供了一个依据。另外我们构建了GFP标签的TRIP表达载体,将其转染到HEK293细胞系中,直接用荧光显微镜观察,发现相同现象。1.3TLR不影响TRIP在细胞内定位将RAW264.7铺小平皿，静置培养16-24h, LPS或Poly (i:c)刺激30min,60min,提取细胞浆蛋白和细胞核蛋白,调节浓度后进行Western Blotting,结果显示LPS或Poly(I:C)刺激细胞后,RAW264.7细胞中TRIP并没有出现出核或入核情况。由于TRIP主要位于细胞浆中,且刺激后没有发生明显入核,说明TRIP可能主要作用于胞浆蛋白。2. TRIP负向调控TLR及RLR介导的IFN-β的产生2.1TRIP抑制TLR3/4介导的IFN-β产生为进一步验证TRIP是否参与到TLR3/4介导的IFN-β的影响,我们构建了TRIP的表达载体,并在公司合成了小鼠TRIP的干扰RNA。在HEK293细胞系中转染TRIP的表达载体,进行Vestern Blotting,用相应标签(FLAG,Myc)抗体孵育,发现TRIP表达良好。用淀粉诱导C57小鼠的巨噬细胞,转染TRIP的干扰RNA,进行Western Blotting,用TRIP特异性抗体孵育,发现TRIP干扰RNA的干扰效率很高。将TRIP干扰后的小鼠巨噬细胞用LPS, Poly(I:C)刺激细胞,通过RT-PCR及ELISA分别检测IFN-β的mRNA水平及分泌水平的变化,结果显示,进行干扰TRIP后,LPS, Poly(I:C)刺激的IFN-β的mRNA水平及分泌水平都出现明显升高，这预示着TRIP可以负向调控TLR3/4介导的IFN-β的产生。为验证超表达TRIP后对TLR通路介导的IFN-β产生是否有相反的效果,由于HEK293没有TLR,因此我们选用了293-TLR3细胞系,转染TRIP表达质粒24h,加Poly(I:C)刺激,即刻活化TLR3信号通路,用时转染IFN-β告基因,发现超表达的TRIP会抑制IFN-β的报告基因活性。2.2TRIP抑制RIG-I介导的IFN-β产生用Poly (I:C)转染HEK293的方法可以模拟活化RIG-I信号通路,因此我们在HEK293中转染TRIP超表达载体,发现TRIP会抑制转染Poly (I:C)所介导的IFN-β的产生。RAW264.7(?)胞系瞬时转染i NOS, GAS(?)报告基因，用IFN-γ刺激细胞,活化IFN信号通路,发现高表达的TRIP对IFN-γ介导的信号通路没有影响,这也说明了TRIP对TLR和RLR信号通路的影响具有一定的特异性。用转染小干扰RNA的方法将小鼠腹腔原代巨噬细胞的TRIP进行干扰,用Sev感染细胞,活化RIG-1信号通路,分别用RT-PCR, ELISA用报告基因方法检测IFN-β的m RNA水平,分泌水平及报告基因活性水平的变化。结果显示干扰TRIP后，Sev介导的IFN-β的产生量明显升高。3. TRIP调控IFN-β的分子机制3.1TRIP负向调控转录因子IRF3活性IRF3足TLR,RLR活化产生IFN-3的最重要的转录因子,所以我们想探讨TRIP会不会影响IRF3的活性,进而影响IFN-β的产生。首先利用报告基因技术,将IRF3的报告基因与TPIR超表达质粒共转染RAW264.7,用LPS,Poly(I:C)刺激消化TLR3/TLR4信号通路,或者将IRF3报告基因与TRIP超表达共转染HEK293,然后的转染Poly (I:C)的方法活化RIG-I信与通路,发现TRIP会抑制TLR及RLR之介导的IRF3报告基因活性。将RIG-I,MAVS及TBK1的超表达载体与IRF3报告基因共转染HEK293,活化IRF3报告基因，发现超表达的TRIP会抑制IRF3的报告基因活性，这一方面说明IRIP会负向调控RLR介导的IRF3活性，另一方面说明，TRIP的作用靶点在TBK1或者更下游位置。进而我们想探讨TRIP会不会影响IRF3磷酸化情况，首先我们转染TRIP超表达质粒HEK293中，然后转染Poly (I:C活化RLR信号通路，检测蛋白磷酸化情况，发现超表达TRIP可以降低RLR信号通路介导的IRF3磷酸化水平。将TRIP干扰RNA转染小鼠腹腔巨噬细胞，36小时后，用Poly (I:C刺激细胞，观察磷酸化情况，发现干扰TRIP后TLR3介导的IRF3磷酸化水平明显升高。3.2TRIP的作用靶点为TBK1为了确定TRIP在TLR及RLR信号通路中的作用靶点，我们将RIG-I-,MAVS-, TBK1-, TRIF-及MDA5的表达载体与TRIP的表达载体共转染HEK293,通过RT-PCR技术发现TRIP负向调控这些接头蛋白介导的IFN-β的mRNA表达水平。同样将RIG-I-,MAVS-, TBK1-, TRIF-, MDA5,及IRF3-5D的表达载体与TRIP的表达载体和IFN-β报告基因的表达载体共同转染HEK293,报告基因结果表明,TRIP负向调控除IRF3以外的所有接头蛋白介导的IFN-β的报告基因活性。以上结果说明了TRIP的作用靶点可能是TBK1而非IRF3。3.3TRIP将TBK1进行特异性的降解因为TRIP具有降解作用,但TRIP的作用靶点还不得而知,因此我们首先在腹腔原代巨噬细胞中,将TRIP进行干扰,分别用LPS, Poly (I:C)刺激细胞,进行Western Blotting,结果发现对TRIP进行干扰后,内源性TBK1的表达量明显升高,而IRF3, TRAF3, STAT1的表达并未受到影响。相反的,我们利高表达TRIP质粒的RAW264.7稳定株,重复上面的实验,结果发现高表达TRIP后,TBK1的表达量明显降低,而TRAF3, TRAF6表达无变化。这说明在免疫细胞中,TRIP具有特异性降解TBK1的作用。将TBK1表达载体与TRAF3表达载体分别与TRIP表达载体共转染HEK293,发现超表达的TRIP可以抑制TBK1载体的表达,而对TRAF3载体的表达没有影响,当加入蛋白酶体抑制剂后TRIP对TBK1载体表达的抑制作用消失。为了确定TBK1的激酶活性会不会因为降解而发生变化,我们进行了激酶检测实验,结果证明对TRIP进行干扰后LPS介导的TBK1激酶活性的发生明显增强。以上结果说明TBK1是TRIP的降解靶点,TBK1的激酶活性也因此受到TRIP的负向调控3.4TRIP将TBK1进行K48位的泛素化泛素化是机体内常见的一种蛋白质修饰形式,在TLR及RLR信号通路中发挥着重要的功能,K48位泛素化可以将目的蛋白进行特异性的蛋白酶体方式降解。TRIP含有锌指结构域,之前也有文章预测其可能具有E3泛素连接酶功能,根据上面的降解实验,我们猜测TRIP可能会将TBK1进行K48位泛素化。E3连接酶将目的分子泛素化的的前提是两个分子发生结合,因此,首先我们将TBK1表达载体,IRF3表达载体与TRAF3表达载体分别与TRIP表达载体共转染HEK293,免疫共沉淀实验结果发现TRIP可以与TRAF3, TBK1发生结合。将RAW264.7用LPS刺激后,用TBK1特异性抗体做免疫共沉淀,发现TRIP可以与TBK1发生内源性结合.由于TRIP仅对TBK1进行降解,对TRAF3没有作用,因此我们猜测,TRIP的泛素化靶点应该是TBK1.我们要进一步确定TRIP是否能将TBK1进行泛索化,首先我们将野生型TRIP,E3连接酶活性缺失点突变TRIP与TBK1表达载体,泛索表达载体共转染HEK293,免疫共沉淀后发现,TRIP可以将TBK1进行泛素化。进一步要证明泛素化以何种形式进行,我们将TRIP表达载体,TBK1表达载体分别于野生型泛素表达载体,K48位点突变泛素表达载体,K63位泛素表达载体共转染HEK293,免疫共沉淀发现,TRIP可以将TBK1进行K48位泛素化而非K63位泛素化。4. TRIP抵抗病毒的生理意义4.1TRIP抑制病毒介导的IFN-β的产生IFN-β在机体抵抗机体抵抗病的重要分子,前面已经证明TRIP可以负向调控RIG-1介导的IFN-β的产生,那么TRIP会不会影响病毒介导的IFN-β产生,进而影响VSV的复制?首先将TRIP过表达载体转染HEK293,进而用Sev感染细胞活化IFN-β(?)的产生,RT-PCR及ELISA结果显示，TRIP过表达可以负向理控Sev介导的IFN-β及RANTES f的产生。在HEK293I中利用共转染及报告基因技术,我们可以看到TRIP可以负向调控Sev介导的IFN-β报告基因活性。而将TRIP在小鼠腹腔原代巨噬细胞中进行干扰后，再用Sev感染,结果发现干扰TRIP后Sev介导的IFN-β的产生明显升高。将IRIP在HEK293十进行过表达,Sev感染后进行非变性电泳,结果发现过表达TRIP会抑制IRF3的二聚化。在IIEK293中转染TRIP超表达载体,用Sev刺激时间点，Western Blotting结果显示，干扰TRIP可以促进内源性TBK1的表达,磷酸激酶实验同样证明HRIP可以降低TBK1的激酶活性。这些结果说明TRIP可以负向调控Sev介导的IFN-β的产生。4.2TRIP促进病毒的逃逸前面一系列结果展示了TRIP可以影响病毒介导的IFN-β的产生，我们想探讨TRIP是否可以直接调节病毒的复制。我们选用了VSV病毒，该病毒同Sev一样是单链RNA病毒，可以活化RIG-I介导的FN-β,比更适用于病毒空斑实验研究。首先将TRIP过农达载体转染HEK293,24小时后,用Poly(I:C转染HEK293,6小时后用VSV感染,培养24小时收集上清及细胞RNA,结果显示,过表达TRIP可以直接促进VSV的复制,而TRIP的E3连接酶活性缺失突变体则失去这一功能。将TRIP的干扰RNA转染小鼠腹腔巨噬细胞,36小时后用Poly(LC)刺激细胞,6小时后再用VSV感染,24小时后收集上清及细胞RNA,结果显示,将TRIP进行干扰后可以直接抑制VSV的复制。四.结论及创新性1.世界上首次证明TBK1的K48位泛素化调控方式TBK1是固有免疫信号通路中非常重要的一员,通过其磷酸激酶活性调控大量基因的表达,TBK1激酶活性是如何调控的还不太清楚。已有文献报道,TBK1可以被磷酸化或K63位泛素化,进而促进TBK1及活化,但TBK1如何被负向调控至今仍未有报道,我们首次证明TBKl可以被TRIP进行K48位泛素化,进而发生降解,完善了RLR及TLR的信号转导过程。2.首次证明了TRIP具有体内泛素化功能已有报道对TRIP的结构功能进行了预测,猜测TRIP是一种E3泛素连接酶,并进行了体外泛素化验证,但TRIP是否在体内具有泛素化功能,其作用靶点是什么都还不知道,我们的研究证明TRIP在体内的确是一种E3连接酶,并通过其泛素化功能调节TLR剂RLR信号通路。3.揭示了一条新的病毒逃逸机制病毒感染机体后,机体会对病毒杀伤,而病毒也会产生抵抗机体的逃逸机制,两种作用相互抗衡。我们研究发现单链RNA病毒感染机体后产生IFN-β杀伤病毒,同时病毒会诱导机体高表达TRIP,高表达的TRIP负反馈调控RLR及TLR信号通路,关闭IFN-β的生成,促进病毒的逃逸。5.为抗病毒药物的研发提供了新的靶点目前全世界病毒泛滥,如HBV, HIV, SARS以及刚刚发现的H7N9等,因此生产研发针对病毒的药物迫在眉睫,通过我们的研究，可以提出一个假设：如果我们筛选出一种可以特异性降低TRIP表达的药物,当机体感染病毒时服用,TRIP表达量降低,病毒的复制也会随之降低,这位抗病毒药物的研发进行了很好的提示。