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马铃薯Y病毒脉坏死株系(PVY~N)和马铃薯Y病毒普通株系(PVY~O)是马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)的两个主要株系,侵染烟草后分别会引发系统脉坏死和系统性斑驳的症状。amiRNA(artificial microRNA,amiRNA)和 siRNA(small interfering RNA,siRNA)是两种类型的沉默介导因子。这两类小RNA(sRNA),近年来被广泛应用于植物抗病毒研究。本研究以PVY~O的复制酶基因NIb的两个区域作为靶序列,分别设计siRNA和amiRNA,构建4个含有单sRNA的植物表达载体和4个含有双sRNA的植物表达载体,转化烟草,进行抗病性鉴定,比较研究了多sRNA的组合对病毒抗性的影响。研究结果为利用RNA沉默策略高效培育抗病毒转基因植物提供了依据。主要的实验结果和结论如下:(1)以PVY~O复制酶基因NIb的两个区域作为靶序列,按照相关准则分别设计siRNA 和 amiRNA,构建 8 个植物表达载体:pR-siR1,pR-siR2,pR-miR1,pR-miR2,pR-siR1siR2,pR-miR1miR2,pR-siR1miR2 和 pR-miR1siR2。(2)以荧光素酶(luciferase,LUC)作为报告基因与靶基因连接,构建融合基因的表达载体 PVY~N-NIb-LUC 和 PVY~O-NIb-LUC。将 PVY~N-NIb-LUC 和 PVY~O-NIb-LUC 分别与sRNA表达载体瞬时共侵染本生烟,结果显示,sRNA表达载体对PVY~O-NIb-LUC的剪切效率均高达90%以上,尤其是同时表达siRNA和amiRNA的表达载体,剪切效率最高可达94.3%;sRNA表达载体对PVY~N-NIb-LUC的剪切效率为29%-41.5%,但共表达siRNA和amiRNA仍具有相对较高的剪切效率。(3)将构建的8种sRNA表达载体,利用冻融法导入农杆菌LBA4404,叶盘法转化烟草NC89,获得转基因植株,利用卡那霉素抗性筛选和PCR检测,获得各转基因的植株150株以上。(4)转基因植株的Northern blot分析和荧光定量PCR检测表明,各转基因株系中均有sRNA积累,但是积累量存在差异:含双sRNA的转基因株系pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2,sRNA表达量累加后高于含单sRNA的转基因株系 pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2,其中 pR-siR1miR2、pR-miR1siR2 株系的sRNA积累量最高。(5)用含有PVY~N和PVY~O的病毒汁液接种转基因烟草各株系,进行抗病性分析。统计结果表明,pR-miR1miR2、pR-miR1siR2、pR-siR1siR2、pR-siR1miR2、pR-miR1、pR-miR2、pR-siR1、pR-siR2对PVY~N的抗病率分别为 29.33%、34.54%、24.54%、46.95%、18.80%、21.35%、4.04%、8.57%;对 PVY~O 的抗病率分别为52.34%、59.88%、47.25%、69.04%、43.20%、47.12%、42.82%、44.48%。上述结果表明,8种sRNA表达载体的转基因植株均对PVY~O表现出较高的抗性,尤其是共表达siRNA和amiRNA的转基因植株,抗病率最高可达近70%;推测是由于碱基错配造成转基因植株对PVY~N的抗性相对较低,但共表达siRNA和amiRNA的转基因植株仍可介导相对较高的抗性水平,表明这样的组合方式能有效减少错配造成的病毒逃逸。(6)抗病和感病转基因植株Northern blot分析结果显示,转基因在RNA水平上得以表达,并且抗病植株中mRNA的积累量明显低于同类型的感病植株;抗病转基因植株中sRNA的积累高于感病植株;表明病毒抗性是由RNA介导的,抗性与sRNA积累量成正相关。(7)转基因植株Southern blot分析结果显示,外源基因已经成功整合到烟草的基因组中,部分转pR-siR1miR2、pR-miR1siR2的高抗病毒植株中,存在1-2个拷贝的转基因。(8)对T1代进行抗病性分析发现,高抗型转基因植株的后代仍保持对病毒的高度抗性,表明siRNA和amiRNA介导的抗性稳定遗传到T1代。