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目的：通过与传统NK细胞和CIK细胞体外扩增方案比较,建立高效高质量的NK细胞体外扩增方案,并探讨其杀伤机制。方法：以传统的NK细胞体外扩增方案(方案1)为基础,分别加入IL-18(方案2)和IL-7(方案3),并以CIK体外扩增方案(方案4)为对照。流式细胞法检测四组方案体外扩增过程中第0天、第5天、第10天、第15天的淋巴细胞内各亚群比例变化,尤其是NK细胞和NK-T细胞比例变化情况。比较每种方案NK细胞和NK-T细胞扩增比例。比较不同方案体外扩增15天后总细胞数、NK细胞数(比例)和NK-T细胞数(比例)及它们的扩增倍数。LDH释放法检测不同方案扩增产物对K562细胞系的杀伤力。ELISA法检测不同方案第5天和第15天培养上清IFN-γ和TNF-α的分泌量变化。LDH释放法检测NK细胞和NK-T细胞对缺少MHC表达的细胞系K562、MHC匹配的细胞系MDA-MB435和MHC不匹配的细胞系MCF-7的杀伤；以及分别封闭KIR或NKG2D后的NK细胞和NK-T细胞对上述三种细胞系的杀伤。比较NK细胞和NK-T细胞对上述三种细胞系杀伤力的不同,同时比较KIR和NKG2D受体的封闭对NK细胞和NK-T细胞杀伤的影响。结果：四组方案同时体外扩增乳腺癌患者外周血15天过程中,只有方案2可见NK细胞的明显扩增(P=0.043)；而方案4可见NK-T细胞明显扩增(P=0.010)。方案2扩增的NK细胞比例最高,占细胞总数的72.2%±21.93%,与其他三组方案相比均有统计学意义(P=0.012,0.034,0.002)。四组方案总细胞扩增倍数分别为33.6±20.51、38.07±23.61、39.57±23.76、63.67±26.13。NK细胞扩增倍数分别为40.48±31.93、203.46±77.04、55.89±28.66、14.63±14.21。组间比较2号方案扩增NK细胞倍数明显高于1号、3号和4号方案(P=0.002,0.004,0.001)。四组方案体外扩增乳腺癌患者外周血15天后,总细胞数由2.5×106,分别扩增至(8.44±6.2)×107、(9.5±7.2)×107、(9.9±7.2)×107、(1.6±0.8)×108。NK细胞数由(5.0±1.4)×105分别扩增至(2.3±2.1)×107、(7.9±6.7)×107、(3.0±2.0)×107、(7.2±7.9)×106。四组方案体外扩增15天后,2号方案扩增产物对K562细胞系的杀伤力最强,且在效靶比40：1条件下与3号和4号方案比较均有统计学意义(P=0.016,0.001)。磁珠分选出的纯化CD3-CD56+NK细胞在效靶比40:1条件下对K562细胞系的杀伤力明显高于对MDA-MB435细胞系和MCF-7细胞系的杀伤(P=0.019,0.022),而纯化后的CD3+CD56+的NK-T细胞对MDA-MB435细胞系的杀伤力明显高于对K562细胞系和MCF-7细胞系的杀伤力(P=0.001,0.005)。在效靶比40：1条件下,纯化后的NK细胞对K562细胞系的杀伤力明显高于NK-T细胞对其的杀伤(P=0.012)。NK细胞对K562细胞系的杀伤力明显高于封闭KIR的NK细胞和封闭NKG2D的NK细胞对K562细胞系的杀伤力(P=0.014,0.037),而封闭NKG2D的NK-T细胞失去MHC限制性的杀伤,但KIR封闭抗体对其影响不大。结论：2号体外扩增NK细胞方案(IL-2+IL-15+IL-18)能高效高质量的扩增NK细胞,且扩增产物杀伤力强。2号方案扩增产物以NK细胞为主,兼有NK-T细胞。两种细胞杀伤机制不同：经磁珠分选出的纯化NK细胞无MHC限制,对K562细胞系杀伤敏感,且KIR和NKG2D在NK细胞的杀伤中起重要作用；NK-T细胞杀伤以T细胞杀伤为主,兼有NK细胞杀伤特性。NKG2D在NK-T细胞的MHC限制性杀伤中起重要作用,而KIR对其影响不大。