马铃薯晚疫病是由致病疫霉菌(Phytophthora infestans(Mont.)de Bary)引起,能够导致马铃薯的大幅减产,甚至绝收,严重威胁着马铃薯生产,被视为国际第一大作物病害。其病原菌在与植物协同进化的过程中,会分泌丰富的Rx LR类效应分子,发挥了不同的致病作用,成为侵染的“武器”;同时,植物免疫系统进行防卫反应形成“盾”,目前鉴定的抗晚疫病基因,其识别的无毒基因也都属于病原菌Rx LR类分泌蛋白。由于马铃薯栽培品种是四倍体作物,自交不亲和,通过杂交的方法将野生种中鉴定的抗病基因导入到栽培品种从而获得抗病效果的策略只能在有限的资源中利用。因此,从野生种质资源中鉴定抗晚疫病基因并利用基因工程技术培育转基因抗病马铃薯品种成为重要的防治策略之一。龙葵作为马铃薯晚疫病非寄主茄科植物,对马铃薯晚疫病菌具有很好的抗性,预测携带相应的抗病基因资源。本研究通过构建我国A1融合群晚疫病黑龙江分离菌株HLJ1的Rx LR蛋白基因池,进而在非寄主龙葵上筛选候选无毒基因并进行分析,帮助解释非寄主抗性的遗传基础并后续帮助从龙葵中克隆抗病基因。目前,取得的研究成果包括以下几点:1.参考已测序菌株T30-4基因组序列,以HLJ1菌株的gDNA为模板,通过高保真PCR,成功克隆并构建251个Rx LR效应因子的瞬时表达载体。利用生物信息学手段分析两个菌株T30-4和HLJ1基因组中Rx LR分子的多态性,除了8个基因在部分菌株中存在等位基因缺失外,其它Rx LR效应分子存在对应的等位基因。等位基因之间编码氨基酸序列完全相同数量相对较多,部分基因存在不同数量的多态性。2.为研究Rx LR效应因子的功能,利用PVX介导的瞬时表达系统将构建的Rx LR效应子分别在本氏烟和龙葵上进行瞬时表达,筛选得到3个仅能在龙葵上触发过敏性坏死(HR)的基因,作为候选抗性无毒基因(Pi15718、Pi15556、Pi21190)。通过荧光定量分析发现这三个基因在HLJ1侵染过程中表达量都出现明显变化。通过对这3个Rx LR效应分子的功能结构域的截短分析发现,确定其与龙葵识别产生HR的关键区域都在C-端。3.进一步解析Pi15718的功能,对其在10个晚疫菌株中的多态性进行分析发现存在两种类型的氨基酸序列,其中Pi15718HLJ1类可以在除龙葵品种(SN005)外的其他测试的龙葵上均产生HR,Pi1571888069类不能在龙葵上产生HR。推测氨基酸改变影响其在龙葵上产生HR的功能。有意思的是,Pi1571888069和Pi15718HLJ1的C末端单独可以激发龙葵的HR,暗示Pi1571888069N-端具有抑制C-端激活龙葵HR的功能。酵母双杂交验证N-端并不与C-端发生蛋白的互作。N-端抑制功能的关键位置确定在Pi1571888069的第45-52位的氨基酸之间。同时,为研究该候选无毒基因的功能,稳定的转基因株系以及酵母双杂交筛选互作蛋白的工作也在进行中。4.针对候选无毒基因Pi15556,研究发现在15个晚疫菌株中高度保守,氨基酸序列完全一致。其在供测的龙葵样本SN004、SN005、SN008中也不激发HR,体现无毒基因的特征。为了研究其在菌株中的功能,构建Pi15556的抑制突变体菌株,在鉴定了突变率分别为61.9%和34.7%的突变体M-1和M-2。对突变体进行生物学分析发现Pi15556并不影响菌落形态,菌丝生长和孢子囊形态,但预测可能通过影响产孢能力影响致病性。5.Pi21190也有类似结果,在不同的龙葵材料中分别可激发或者不激发HR反应,体现无毒基因的特征。同时,其在不同菌株中存在不同的等位基因,但其等位基因在龙葵SN0022上均产生HR,体现较强的保守性。6.同期筛选到一个可以在本氏烟上抑制INF1产生HR的Rx LR效应分子Pi14684进行等位基因的多态性分析,发现其存在多个氨基酸位点的改变,在本氏烟上瞬时表达结果证明E43K,是其抑制INF1产生HR的关键位点。随后为了研究Pi14684是否特异性的抑制INF1产生HR,分别接种SFI2,Avr3aKI和R3a混合菌液,发现Pi14684仅能特异性抑制INF1介导的HR。