本研究中，以原发性肝癌为治疗目标，以壳聚糖修饰的量子点(CS-Qdots)为基因载体和光动力学治疗的介质，设计了靶向肝癌的基因治疗联合光动力学治疗的体系，并能同时实现肿瘤组织的特异性生物发光成像。　　第一部分 CS-Qdots的制备、表征和生物相容性分析　　目的:研究壳聚糖(chitosan，CS)修饰的CdTe量子点的制备，表征和生物相容性，为其进一步治疗和成像的应用奠定基础。　　方法:以水相直接合成法制备水溶性CdTe（碲化镉）量子点，其表面修饰壳聚糖成为CS-Qdots纳米颗粒。运用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)、高分辨透射电子显微镜(high resolution electron microscopy，HREM)、ZETA电位分析仪、荧光分光光度计(fluorescence spectrophotometer)、X射线衍射分析(x-ray diffraction，XRD)和傅里叶转换红外线光谱分析(Fourier Transform infraredspectroscopy，FTIR)等技术对CdTe和CS-Qdots进行特性研究;采用细胞MTT(methyl thiazolyl tetrazolium)试验检测CS-Qdots体外生物相容性;采用体外溶血试验测定CS-Qdots的血液相容性;以治疗浓度将CS-Qdots注射入小鼠尾静脉后观察CS-Qdots在小鼠体内的分布情况，对小鼠进行肝肾功能分析，血细胞分析，以及主要脏器的病理学分析。　　结果:制备的CdTe量子点平均粒径大约5nm，最大发射波长为630nm，表面电荷为-16.31±0.10 mV。CdTe表面修饰壳聚糖以后，形成分散性良好，粒径在20-30nm左右的颗粒，表面带正电荷（28.02±0.74 mV）。经傅里叶转换红外线光谱分析，在FTIR图谱上显示出壳聚糖的特征峰。体内外的生物相容性试验显示，相比较CdTe量子点，CS-Qdots具有较好的生物相容性，细胞毒性评价为1级，且符合医用材料的溶血试验要求。经尾静脉注射入裸鼠体内72小时以后主要聚集在肝脏，在肾脏有少量分布，极少在肺、心脏和脾脏聚集。以治疗浓度（400μg/ml）注入尾静脉后72小时，动物血清未见明显的肝肾功能异常，未见明显的血细胞计数异常，裸鼠主要脏器（肝、肾、肺、心、脾）的病理切片上也未见明显的炎症、坏死等异常改变。　　结论:成功构建了粒径20-30nm，最大发射波长为630nm的CS-Qdots。经验证其具有相对较好的生物相容性，为其进一步体内应用打下基础。　　第二部分 肝癌靶向自杀基因p[HRE]AFP-HSVTK和报告基因p[HRE]AFP-luc的构建　　目的:在转录水平对基因的表达进行调控，从而实现自杀基因和报告基因在肝癌细胞内特异性表达。　　方法:通过碱基合成法直接合成甲胎蛋白(AFP，alpha-fetoprotein)启动子的核心区域(0.3kb)作为下游基因在肝癌细胞内特异性表达的启动子，将来源于血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）基因的乏氧反应序列(hypoxia responsive element，HRE)作为增强子与AFP启动子的5端融合，得到杂合启动子[HRE]AFP，将其插入载体pCDNA3.1，替换CMV启动子，下游插入自杀基因HSVTK，得到在肝癌内特异性表达的治疗基因重组载体p[HRE]AFP-HSVTK。用虫荧光素酶基因luciferase替换HSVTK片段，得到肝癌报告基因重组载体p[HRE]AFP-luc。分别用基因测序和限制性内切酶酶切片段电泳方法的检测构建的质粒是否正确。　　结果:构建得到的重组质粒，经酶切片段电泳证明插入片段都在正确位置，片段大小正确。测序显示，AFP启动子，HRE增强子，自杀基因HSVTK碱基序列与GeneBank内相应序列比对完全吻合。　　结论:治疗基因p[HRE]AFP-HSVTK和报告基因p[HRE]AFP-luc构建成功。　　第三部分 CS-Qdots携带治疗基因和报告基因在肝癌细胞内的特异性表达、靶向杀伤效果及活体成像研究　　目的:检测CS-Qdots的转染效率，以其为载体将治疗基因和报告基因转染至不同细胞系的细胞和荷瘤小鼠，检测治疗基因和报告基因是否具有肝癌细胞表达的特异性，并进行靶向杀伤效果及活体成像研究。　　方法:通过双荧光素酶报告基因检测体系，定量检测在不同细胞系内[HRE]AFP启动子的转录效率。以p[HRE]AFP-EGFP为报告基因，检测CS-Qdots的基因转染能力。然后以CS-Qdots为载体通过尾静脉注射对肝癌细胞荷瘤小鼠转染报告基因p[HRE]AFP-luc，转染72小时后，用小动物活体成像系统检测小鼠体内的生物发光信号。再用CS-Qdots将p[HRE]AFP-HSVTK转染至将肝癌细胞和非肝癌细胞内，于乏氧前后检测加入GCV后细胞的增殖率，以检测自杀基因对肝癌的靶向杀伤能力。　　结果:CS-Qdots具有稳定的细胞转染能力，并且可以在体内外对基因的运载进行示踪。报告基因p[HRE]AFP-luc转染至甲胎蛋白表达阳性的肝癌细胞HepG2、阴性的肝癌细胞SMMC7721，成纤维细胞L929和结肠癌细胞LOVO后的双荧光素酶报告基因系统检测结果显示，乏氧诱导下虫荧光素酶的相对表达值在HepG2细胞内增加了2.8倍，在SMMC7721细胞内增加了5.2倍，而在L929和LOVO细胞内乏氧诱导前后几乎不能检测到虫荧光素酶基因的表达。p[HRE]AFP-luc报告基因被CS-Qdots运送进入裸鼠体内后，通过小动物活体成像系统能在肿瘤部位检测到明显的生物发光信号。CS-Qdots/p[HRE]AFP-HSVTK转染后的肝癌细胞(HepG2和SMMC7721)与未转染细胞相比显示出对GCV的敏感性(p＜0.001)，且乏氧诱导后敏感性提高(p＜0.001)。而转染的非肝癌细胞，无论乏氧诱导与否，与未处理细胞相比都缺乏对GCV的治疗敏感性(p＞0.05)。　　结论:CS-Qdots可以作为一种稳定的可示踪的基因载体用于体内外基因转染。[HRE]AFP杂合启动子介导的下游基因具有在肝癌细胞内特异性表达并可被乏氧诱导增强的特性，其介导的HSV-TK/GCV治疗体系仅对肝癌细胞敏感，介导的luc报告基因表达还可用于肝癌的早期诊断和成像。　　第四部分 CS-Qdots/PS介导的肝癌靶向基因治疗联合FUEL-FRET光动力学治疗　　目的:通过体内外试验证明CS-Qdots能通过“非结合的生物发光激发荧光”的方式（fluorescence by unbound excitation from luminescence，FUEL）被激发，并能将能量通过荧光共振能量转移的方式（fluorescent resonce energy transfer，FRET）转移给光敏剂，引发光动力学治疗效应。并检测体内外基因治疗联合FUEL-FRET光动力学治疗对肝癌的杀伤作用。　　方法:通过细胞外直接激发、体内外生物发光光谱检测的方法，证明CS-Qdots可以被细胞内产生的生物发光直接激发。将光敏剂卟吩姆钠与CdTe量子点共同包裹于壳聚糖中构成CS-Qdots/PS纳米粒，以其作为载体，转染p[HRE]AFP-luc至HepG2细胞后，检测细胞内产生的活性氧簇，还原型谷胱甘肽(GSH)，总GSH，氧化型谷胱甘肽(GSSG)以及还原型GSH与GSSG的比例，从而检测细胞在氧化压力下对还原型GSH的消耗;检测细胞内Caspase3的活性;并用MTT试验检测细胞的增值率。对肝癌细胞进行体内外基因治疗、FUEL-FRET光动力学治疗以及二者的联合治疗，通过细胞增殖率、瘤体在体生长速度、瘤体质量等指标检测各组治疗方法的抑瘤效果，并检测裸鼠的肝肾功能、血细胞分析、主要脏器的病理改变来分析治疗方法对裸鼠主要脏器和生理功能的影响。　　结果:试验结果证明CS-Qdots可以通过FUEL的方式被生物发光信号直接激活，检测到的生物发光信号的最大发射波长从560nm跃迁到630nm。用含有光敏剂的CS-Qdots/PS将p[HRE]AFP-luc基因转染至肝癌细胞后，在避光条件下加入底物后，相比较未处理细胞阴性对照组，检测到细胞中了产生的大量活性氧簇(ROS)，还原型GSH被消耗，GSSG含量上升，细胞caspase3活性上升。体内外的抑瘤试验中，与单独治疗组相比较，基因治疗联合FUEL-FRET光动力学治疗组取得最明显的抑瘤效果，肿瘤生长速度显著下降。通过对体内试验中FUEL-FRET光动力治疗组的瘤体细胞进行亚细胞结构分析发现，光动力学治疗组的细胞产生大量空泡，线粒体受损严重，各个治疗组细胞均有凋亡的结构改变。　　结论:CS-Qdots可以通过FUEL的方式被细胞内产生的生物发光信号直接激活，CS-Qdots/PS纳米粒将p[HRE]AFP-luc基因转染至肝癌细胞后通过FUEL-FRET的方式传递能量，激发光敏剂，在细胞内产生光动力学治疗效应。在体内外的肝癌抑瘤试验中，相比较单独治疗组，光动力学疗法联合基因治疗显示出最明显的抑瘤效果，治疗过程对裸鼠的主要脏器的形态和功能没有产生明显影响。