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线粒体是细胞内重要的细胞器,它作为调控细胞凋亡的关键检查点,可以感应和放大细胞的损伤。当线粒体发生外膜通透后会释放出大量的促凋亡信号分子,而Bcl-2家族蛋白被视为线粒体依赖的细胞凋亡的重要调节因子,同时线粒体融合和分裂的动态变化也参与调节细胞凋亡。Drp1通过磷酸化与去磷酸化实现在胞浆与线粒体中的穿梭,并对线粒体分裂起“开”与“关”的调控作用。此外,富含大量水解酶类的酸性细胞器溶酶体也与细胞凋亡密切相关。本文针对溶酶体通过调控线粒体动态变化而参与细胞凋亡的新机制进行了系统研究。 本文首先利用LeuLeuOMe诱导SH-SY5Y细胞溶酶体发生膜通透,构建依赖溶酶体的细胞凋亡模型。溶酶体发生膜通透后,胰凝乳蛋白酶从溶酶体释放进入胞浆,引发线粒体释放细胞色素c、Caspase3激活并剪切底物PARP等事件,提示发生了典型的细胞凋亡;胰凝乳蛋白酶特异性抑制剂TPCK能部分抑制Caspase3的活化并阻断细胞凋亡,说明溶酶体膜通透后释放的胰凝乳蛋白酶是诱导细胞凋亡的关键分子。同时,我们发现伴随溶酶体膜通透的过程,线粒体也发生分裂。TPCK预处理可以部分抑制线粒体的分裂,说明胰凝乳蛋白酶参与凋亡细胞中线粒体的分裂过程。 接下来我们对于凋亡细胞中溶酶体膜通透引发线粒体动态变化的分子机制进行了系统探索,并找到了胰凝乳蛋白酶的下游信号分子——钙调神经磷酸酶。我们发现钙调神经磷酸酶可被胰凝乳蛋白酶剪切为约47 kDa的大片段和13 kDa的小片段。钙调神经磷酸酶的47 kDa大片段表现出不依赖于Ca2+/CaM的高磷酸酶活性,它可以使包括Drp1在内的多种蛋白去磷酸化,其中Drp1 Ser637位点的去磷酸化与线粒体分裂密切相关。以上结果表明存在一条全新的溶酶体-线粒体依赖的细胞凋亡途径,即溶酶体发生膜通透后,胰凝乳蛋白酶被释放进入胞浆,并剪切激活钙调神经磷酸酶;活化的钙调神经磷酸酶截断体可以使Drp1去磷酸化,并使其由胞浆转位至线粒体,介导Drp1调控的线粒体分裂,从而促进线粒体依赖的细胞凋亡。 线粒体除参与调控细胞凋亡之外,还与细胞分化、增殖等过程密切相关,并参与肿瘤等重大疾病发生发展的过程。线粒体最主要的生理功能是进行氧化磷酸化为机体提供能量。然而,大多数肿瘤细胞与正常细胞不同,它们更偏好利用产能率较低的糖酵解途径为其供应能量。这种异常的能量代谢(Warburg效应)作为肿瘤的基本特征之一,被予以高度关注。但另一方面,线粒体内的氧化磷酸化对于许多肿瘤细胞也是必须的。肿瘤细胞如何调控线粒体功能、实现糖酵解与氧化磷酸化的动态平衡、实现应激条件下能量代谢的重塑是肿瘤分子细胞生物学的前沿热点之一。线粒体氧化磷酸化功能主要是通过呼吸复合物协作完成,而这些呼吸复合物是由细胞核基因和线粒体基因共同编码合成的。因此,线粒体自身基因的编码系统发挥了至关重要的作用。本论文针对线粒体蛋白翻译延伸因子mtEF4的生理及病理功能进行了初步探索。 本文首先在多例原发乳腺癌病人组织中发现mtEF4表达均明显升高。我们发现干扰mtEF4表达对肿瘤细胞的体外侵袭和迁移能力具有显著的抑制作用,并抑制肿瘤细胞在体内的远端转移;而过表达mtEF4可以有效促进肿瘤细胞的体外侵袭和迁移能力,并促进肿瘤细胞的体内转移。这说明mtEF4可以影响恶性肿瘤细胞的转移能力。在此基础上,我们对mtEF4影响肿瘤细胞转移的机制进行了研究,发现干扰mtEF4可以使线粒体形态和分布发生变化,即线粒体倾向于绕细胞核分布而远离细胞边缘。敲低mtEF4会下调一些复合物亚基的蛋白水平,并降低复合物的酶活性,从而降低线粒体的氧化磷酸化能力,使ATP水平下降。在此情况下,即使糖酵解水平代偿性升高,也不足以弥补肿瘤细胞ATP水平的不足,进而抑制细胞骨架F-actin的组装和片状伪足的形成、减弱肿瘤细胞迁移及侵袭的能力。与之相对应,过表达mtEF4则提高线粒体氧化磷酸化水平,使ATP水平上升。以上结果提示我们mtEF4可能通过调节线粒体翻译而调控线粒体呼吸,从而影响肿瘤的发生和发展,但具体机制仍有待进一步研究。